Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы генерировать широко распространенную демиелинацию коры обоих полушарий головного мозга в модели крысы с использованием субклинической иммунизации против гликопротеина миелина олигодендроцитов с последующей инъекцией цитокинов через имплантированный катетер. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях головного мозга, таких как рассеянный склероз. Основным преимуществом этого метода является то, что он может генерировать демиелинацию серого вещества, вызванную воспалением, в коре обоих полушарий головного мозга, не приводя к закупорке белого вещества.
Последствия этого метода распространяются на лучшее понимание механизмов кортикальной демиелинизации, которая наблюдается в основном при прогрессирующих типах рассеянного склероза. Чтобы начать эту процедуру, соберите катетер и колпачок катетера с входом. Далее скальпелем разрезаем катетер на длину до двух миллиметров.
Затем побрить голову обезболенной крысы между ушами с помощью электробритвы. Поместите крысу в стереотаксическую рамку и закрепите ее голову с помощью ушных перекладик и прикусной пластины. Убедитесь, что голова горизонтальна и проверьте ее устойчивость, надавливая на нее пальцем или щипцами.
После этого нанесите смазывающие глазные капли, чтобы предотвратить сухость роговицы во время операции, накройте глаза непрозрачным материалом, чтобы предотвратить любое хирургическое воздействие света. Далее очищают бритую область, чередуя применение 70% этанола и 10%повидон йодного комплекса. Чтобы имплантировать катетер, сделайте продольный разрез длиной около двух сантиметров по средней линии.
Затем используйте бульдожьи зажимы, чтобы держать кожу в стороны. Удалите кровь с помощью аппликатора из хлопкового наконечника. После этого удалите покостница, очистите ткань аппликатором хлопкового наконечника, обнажите череп и дайте ему высохнуть в течение примерно одной минуты.
Далее выявляют анатомические ориентиры, лямбда, брегму и медиаальный шов. Установив дрель на стереотаксическую раму, расположите наконечник сверла в брегме в качестве отправной точки. Переместите два миллиметра с задней стороны от брегмы и на 2,4 миллиметра с боков к медиальному шву.
Затем просверлите отверстие диаметром 0,5 миллиметра для катетера в этом положении. Просверлите еще три отверстия диаметром 1,3 миллиметра для анкерных винтов на расстояние нескольких миллиметров от первого отверстия. Удалите костную пыль путем орошения примерно одним-двумя миллилитрами стерильного PBS и очистите череп.
Впоследствии затяните анкерные винты на два-три полных оборота. Вставьте катетер длиной два миллиметра через первое отверстие, перпендикулярное поверхности черепа. Все еще удерживая катетер, нанесите немного зубного цемента и дайте ему полимеризоваться с коротким воздействием света отверждения зубов, чтобы стабилизировать катетер.
Затем нанесите больше зубного цемента вокруг катетера, закрепите винты и затвердите зубной цемент с помощью зубного отверждающего света в течение примерно 15-30 секунд, убедитесь, что цемент затвердел. После имплантации закройте кожу рассасываяся швами с передней и задней стороны катетера. Затем вводят смесь антидота подкожно.
Далее вводят 2,5% энрофлоксацин путем подкожной инъекции для профилактического лечения антибиотиками. Верните животное в модифицированную клетку и держите его под наблюдением в течение одного-трех часов с применением инфракрасного света, чтобы избежать переохлаждения. Повторите лечение энрофлоксацином и вводят карпрофен по одному миллиграмму на миллилитр подкожно для облегчения боли путем инъекции на следующий день после операции.
Для приготовления иммунизационной смеси соедините два 10-миллилитровых нижних стеклянных шприца с запорным наконечником к коротким рычагам трехстороннего запорного крана и закройте третье выходное отверстие длинным рычагом. Далее пипетка один миллилитр IFA и 50 мкг rMOG вместе. И отрегулируйте смесь до конечного объема в два миллилитра со стерильным PBS.
Поместите разбавленный раствор IFA и rMOG в открытый шприц, затем аккуратно вставьте поршень, сохраняя при этом слабое давление на противоположный поршень. Эмульгируйте инокулятивный, перегоняя его из одного шприца в другой, толкая поршни вперед и назад, пока он не будет белым и вязким. Далее прикрепите один миллилитр нижнего стопорного шприца к открытому короткому плечу трехстороннего запорного крана и заполните его инокулятором.
Распределите весь инокулят по одному миллилитру шприцев и держите их на льду до инъекции. Впоследствии вводят 200 микролитров смеси IFA и rMOG подкожно в хвостовое основание под временную изофлурановую анестезию с использованием иглы 21 калибра. Для внутримозговой инъекции цитокинов отрегулируйте длину соединительной канюли до двух миллиметров.
Наполните шприц на один миллилитр смесью цитокинов. Затем подключите шприц к разъему канюли. Затем заполните канюлю смесью цитокинов, избегая создания пузырьков.
Затем установите шприц на программируемый шприцевой насос и запрограммируем его на впрыск со скоростью 0,2 микролитра в минуту. Запустите насос и поддерживайте его в рабочем состоянии, чтобы избежать образования пузырьков воздуха на кончике канюли. После этого снимите колпачок катетера с помощью входного отверстие.
Вставьте соединительную канюлю в катетер, закрутите и затяните ее. Затем дайте инъекции продолжаться в течение 10 минут, прежде чем остановить насос. Оставьте канюлю внутри катетера на 20 минут, чтобы введенный объем полностью рассеялся.
Впоследствии открутите соединительную канюлю и медленно снимите ее, чтобы избежать эффекта вакуума. Прикрепите колпачок катетера к входу и прикрутите его. Дайте животному восстановиться после анестезии в клетке.
Кортикальная демиелинация может быть оценена в разные моменты времени после инъекции цитокина с помощью иммуногистохимии для PLP. На рисунке 6А показана интактная иммунореактивность PLP на 15-й день у могги иммунизированного контрольного животного, которое получало только стерильный PBS через имплантированный катетер. На первый день после инъекции цитокина демиелинация уже могла быть обнаружена у первичных животных MOG.
Хотя и только в непосредственной близости от катетеризированной области. Иммунореактивность PLP остается неповрежденной в контралатеральной коре через один день после инъекции цитокина. На третий день наблюдалось постепенное увеличение потери иммунорегионтности ПЛП, которая распространяется в ипсилатеральной коре.
Контралатеральная кортикальная демиелинация также может быть обнаружена на третий день, но она скорее ограничена областью под анкерными винтами. Между девятым и 15-м дней демиелинизация поражает большие части коры обоих полушарий. Кортикальная демиелинация сохраняется до 30 дней после инъекции цитокина в обоих полушариях с лишь частичной ремиелинией.
На рисунке 6J показана количественная оценка потери PLP в сером веществе коры после внутримозгового введения цитокинов. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как генерировать демиелинацию серого вещества с помощью субклинической иммунизации против миелиновых белков с последующим внутримозговой инъекцией цитокинов через имплантированный катетер. Эта животная модель может помочь исследователям в изучении прогрессирующих типов рассеянного склероза, слой серого вещества демиелинизации является целой меткой.
Имплантированный катетер позволяет проводить несколько раундов демиелинизации или межмозговой доставки потенциальных терапевтических препаратов, проходящих доклиническое исследование, не вызывая травмы, вызванной инъекцией.
