Эта работа была поддержана грантом NS64571 от NINDS (CLH), на ранних награду развития карьеры из клиники Майо (CLH), а щедрый подарок от Дональда и Фрэнсис Herdrich (CLH). Мы хотели бы поблагодарить потока клиники Майо цитометрии основной для получения помощи.

1. Внутричерепное инъекции вируса: Следующий прием был модифицирован и использован широко в нашей лаборатории и коллег. Короче говоря, внутричерепное введение штамма Даниила мышиных энцефаломиелит Theiler это вирус (TMEV) или фиктивных-инфекции (1, 10) проводится на молодых мышей (желательно 5-6 недель), чтобы выявить мозг проникают лейкоциты (BILS). Обратите внимание, что результаты будут отличаться между деформацией Даниила, Боб напряжение, и напряжение GDVII. Для уборки BILS, мыши получать 2x10 5 БОЕ из TMEV и инфицированы в течение 24 часов. <ol><li> Прикрепить инъекционной иглой (27 калибр, ¼ в Кендалл), для автоматического шприца 1 мл Гамильтон и набор для доставки 10 мкл вируса. </li><li> Составить TMEV в 10 мкл DMEM в шприц с пристальное внимание пузырьков воздуха. При необходимости, притворство инфицированных мышей получают 10 мкл вирусов DMEM. </li><li> Просто перед инъекцией, залить примерно 1 мл изофлуран в колоколе, который содержит проволочной сетки с хлопковыми подложки под ним. </li><li> Место мышей direclty на проволочные сетки в колпаком пока они не станут слегка под наркозом, нечувствительным до пят-пинча и обездвижен ингаляционных анестетиков, примерно 10-15 секунд. Мыши не должна быть в непосредственном контакте с изофлуран, как вещество может вызвать раздражение и каустика. </li><li> Находясь под наркозом, подготовить мышей для инъекций за счет быстрого поиска подходящих координатах в лобной области коры на черепе использовании бритья и писать чернилами. Общее расположение для инъекций составляет 1 мм впереди брегмы и 1 мм латеральнее сагиттального шва на правой стороне (рис. 1). Хотя стереотаксической инъекции могут быть неподходящими для некоторых экспериментальных ситуациях, мы обнаружили, что от руки инъекции без бритья или красочного подходит для большинства экспериментов. Расставание меха с острие иглы по обеим осям подходит для инъекций. </li><li> Чтобы сделать инъекцию, ориентироваться иглу перпендикулярно к черепу и нажмите через кость приблизительно 3 мм глубиной. </li><li> Экспресс вируса в мозг, нажав на кнопку Гамильтон шприца вниз и ждать 2 секунды, что вирус может проникать в мозг до снятия. </li><li> Осторожно снимите иглу и место мыши в чистые, сухие клетки. Мыши пробудиться от наркоза быстро и возобновить нормальную работу в течение нескольких минут. Уделять должное внимание мышей, которые обладают ненормальной симптомы, такие как кровотечение из места инъекции, как эвтаназия животного может быть целесообразно. Правильная обработка животных 6 и соблюдение Национального института здоровья и Уходу за животными и руководящие принципы Используйте комитета должны соблюдаться. </li></ol> 2. Брейн-проникновения лейкоцитов подготовке ячейки: <ol><li> Подготовка круглым дном Oak Ridge пробирок в котором можно хранить емкостью 30 мл с 10 мл RPMI 1640, 9 мл Перколла и 1 мл 10 раз PBS и трубки должны сидеть при комнатной температуре на скамейке во время процесса удаления мозга. </li><li> Принесите Ficoll-Paque Plus до комнатной температуры (РТ). </li><li> Усыпить животное изменение изофлуран передозировки 5 и быстро удалить мозга с помощью шпателя из нержавеющей стали ткани и поместите в 15 мл коническую трубку с 5 мл RPMI на льду. В некоторых случаях, ПБС-перфузии может быть целесообразно для удаления циркулирующих клеток периферической крови от подготовки BILS. Мыши должны быть полностью и надлежащим образом анестезии до PBS-перфузии. </li><li> Передача головного мозга и RPMI решение 7 мл стекла Pyrex бренда мясорубку ткани Tenbroeck и мягко гомогенизации с 10-15 ударов. </li><li> Внесите дополнительные 5 мл RPMI в гомогенизатор и пипетки вверх и вниз в два раза. Передача гомогената мозга (около 10 мл) на заранее подготовленные с круглым дном трубки и аккуратно переверните 2-3 раза перемешать. </li><li> Спиновые гомогената мозга при 7800g пр. в течение 30 мин при комнатной температуре в F0360 фиксированным углом ротора в Бекман Allegra X-22R клинической центрифуге. </li><li> После центрифугирования, удалить миелина мусора, который плавал в начало градиента. Сбор лейкоцитарный слой, который парит над эритроцитов гранулы (рис. 2). </li><li> Штамм лейкоцитарного слоя через сито 40 мкм ячейки в 50 мл коническую. Доведите раствор до 50 мл объема с RMPI. </li><li> Спиновые пробирки с разбавленной суспензии клеток в клинической центрифуге при 1500 оборотов в минуту (600 г. пр.) в течение 5 минут при комнатной температуре. </li><li> Аспирируйте супернатант и собрать осадок клеток. Ресуспендируют гранул в 1 мл FACS буфера (1% бычьего сывороточного альбумина, 0,02% азида натрия кальцием и магнием без PBS) и передачи клеточной суспензии по 5 мл круглым дном FACS труб. </li><li> Тщательно подложки подвеска с 1 мл Ficoll-Paque Plus. </li><li> Спиновые трубки при 2500 оборотов в минуту (1400 дал) в клинической центрифуге в течение 25 минут при комнатной температуре, без тормозов. </li><li> Удалить белый, пушистый слой на границе раздела фаз (рис. 2) с 1 мл пипетки и перехода на новые трубки 5 мл FACS. Вымойте слоктя с 4 мл буфера FACS. </li><li> Спиновые трубки при 1500 оборотов в минуту (600 г. пр.) в течение 5 минут при комнатной температуре в клинической центрифуги для осаждения клеток. </li><li> Аспирируйте супернатант и собрать осадок клеток. Ресуспендируют лейкоцитов пеллет в соответствующий буфер и держать на льду в новую пробирку СУИМ. </li><li> Граф клетки, оценивает жизнеспособность клеток Трипановый синий изоляции и анализировать с помощью проточной цитометрии. В общем, следователи могут рассчитывать на приобретение примерно 5 х 10 5 клеток / животное. </li></ol> 3. Проточной цитометрии иммунофенотипирования <ol><li> После выделения и подсчета лейкоцитов, спина клетки в течение 3 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту (600 дал) в клинической центрифуге. </li><li> Ресуспендируют гранул в блокирующем буфере, содержащем следующее: FACS буфера, супернатант из 2.4G2 гибридомы (Fc блок; anti-CD16/32) и эмбриональной телячьей сыворотки в соотношении 10:05:01 и инкубировать 30 минут при 4 ° С . </li><li> Подготовить и добавить конъюгированных антител против внеклеточных антигенов заблокирован клетки в концентрации 1:200 и инкубировать 30 минут при 4 ° С в темноте. Красителей и инкубировать клеток в 200 мкл в 96-и V-нижней пластине. Соответствующие управления включают неокрашенных клеток и флуорохромом образцы компенсации, в случае необходимости. </li><li> Спиновые окрашенных клеток при комнатной температуре в течение 3 минут при 1500 оборотов в минуту (600 дал) в клинической центрифуге использованием ротора подходит для 96-луночных планшетах. </li><li> Аспирируйте супернатант и промыть клетки с 200 мкл буфера FACS, осторожно пипетирования вверх и вниз три раза. </li><li> Повторите описанную выше технику мытье дважды. </li><li> После мытья ресуспендирования клеток в 2% параформальдегида и трансфер в FACS труб. Фиксация необходима для проточной цитометрии клеток, инфицированных по биобезопасности 2-го уровня реагентов. </li><li> Выполнить фиксированных клеток на BD FACS Calibur следующий модифицированный метод проточной цитометрии 8 и анализа файлов оффлайн, используя FlowJo, WinMDI или других имеющихся проточной цитометрии анализа программного обеспечения. </li><li> Анализ 50-100,000 событий на образец, как правило, необходимых для адекватного иммунофенотипирование. </li></ol> Непосредственно конъюгированных антител, используемых в этом эксперименте: CD45 был обнаружен клон с 30-F11. Ly6C / G была обнаружена с клоном Gr1, RB6-8C5. CD11b был обнаружен клон M1/70. F4/80 был обнаружен клон BM8. 4. Представитель Результаты: Мы показываем, клетка фенотипирование результаты для мыши BILS через 24 часа после заражения (рис. 3). Лейкоциты были окрашены PerCP-сопряженных анти-CD45 мыши для выявления иммунных клеток, PE-сопряженных антимышиным Ly6C / G для выявления воспалительных моноциты, APC-сопряженных антимышиным CD11b и APC-сопряженных антимышиным F4/80 обнаружить клетки моноцитов линии. Анализ был проведен с инструментом BD FACS Calibur. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig1.jpg" alt="Рисунок 1"/> Рисунок 1. Анатомические локализации места инъекции. Инъекции находится на расстоянии 1 мм впереди брегмы и 1 мм латеральнее сагиттального шва на правой стороне. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig2.jpg" alt="Рисунок 2"/> Рисунок 2. Иллюстрация градиент разделение лейкоцитов и BILS. Лейкоциты первоначально собраны непосредственно под слоем мусора миелина и выше РБК гранул в градиенте Перколла. Белый, пушистый слой (BILS) на границе взимается с градиентом Ficoll. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig3.jpg" alt="Рисунок 3"/> Рисунок 3. Иммунофенотип мозгов infilatrating лейкоцитов в 24 часов после заражения. Лейкоцитов мыши были выделены из мозга дифференциального центрифугирования плотность ткани гомогенатах приготовленные из животных через 24 ч после внутричерепной инфекции. Клетки окрашивали флуоресцентно конъюгированных антител против CD45 мыши, Ly6C / G, CD11b и F4/80. Первоначальные стробирования был выполнен путем нанесения CD45, маркер для иммунных клеток, от рассеяния вперед (ФСБ), показатель размера ячейки (C). CD45 привет (A, D), CD45 вот (В, Е) и CD45 нег (F, G) населения были затем проанализированы на относительный уровень экспрессии моноцитов и макрофагов маркеры Ly6C / G, F4/80 (A, B , F), и CD11b (D, E, G). Ly6C / G + + F4/80 CD11b + воспалительных моноцитов были обнаружены почти исключительно в CD45 привет населения (A, D), в соответствии с проникновением этих клеток с периферии. В противоположность этому, Ly6C/G-F4/80 вот CD11b + макрофагов были обнаружены почти исключительно в CD45 ло (В, Е) и CD45 нег (G) населения, в соответствии с резидентами фенотипа. В многочисленных экспериментах, мы никогда не наблюдали CD45 привет клеток или Ly6C / G + + F4/80 CD11b + воспалительных моноцитов в мозг неинфицированных или фиктивных-инфекцииТед мышей (данные не приведены).

<ol>
	<li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picornaviruses+and+cell+death.">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li><li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay.">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li><li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li><li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain.">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li><li>Donovan, J., &amp;amp, P. . B. r. o. w. n., , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+&#38;+restraint.">Handling &#38; restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenteral+injections.">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li><li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur.">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li><li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination.">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li><li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theiler's+virus+infection+in+mice:+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination.">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы регулярно пользоваться проточной цитометрии для определения как качества мозг проникают ячейки подготовки, и различать различные популяции иммунных клеток, 2, 9. При острых временных точках, наши BILS метод дает высокий процент воспалительных моноцитов в CD45hi населения, а также в...

<table border="1"><tbody><tr><th> Реагент </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> Хоу Лаборатории </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Даниила напряжение </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> изофлуран </td><td> Novaplus </td><td> НДЦ 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> с круглым дном Дуб Ридж трубы центрифуги </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Перколла </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Roche </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Голубой Трипан 0,4% (м / о) </td><td> Mediatech </td><td> 25-900-CI </td><td></td></tr><tr><td> 15 мл конические пробирки </td><td> BD Сокол </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 мл стекла Pyrex бренда Tenbroeck ткани мясорубки </td><td> Рыболов </td><td> 08-414-10B </td><td></td></tr><tr><td> 40 мкм ячейки фильтра </td><td> BD Сокол </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 мл конические </td><td> BD Сокол </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> бычьего сывороточного альбумина </td><td> Сигма </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> азид натрия </td><td> Сигма </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF-PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> FACS труб </td><td> BD Сокол </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> эмбриональной телячьей сыворотки </td><td> Сигма </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 гибридомы </td><td> АТСС </td><td> HB-197 </td><td></td></tr><tr><td> Costar V-нижняя пластина </td><td> Гранулирование </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra X-22R центрифуги или эквивалент </td><td> Бекман </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 96-луночного ведро пластины и ротора </td><td> Бекман </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> Фиксированным углом ротора </td><td> Бекман </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> параформальдегид </td><td> Сигма </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 7,5 </td><td> Дерево Звезды, Inc </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557235 </td><td> Клон: 30-F11 </td></tr><tr><td> Gr1 (Ly6C / G) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553128 </td><td> Клон: RB6-8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> Клон: M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> Клон: BM8 </td></tr></tbody></table>

isolation of brain-infiltrating leukocytes

Мы опишем способ получения мозг проникают лейкоциты (BILS) от мышей. Мы показываем, как заразить мышей с мышиным энцефаломиелит Theiler это вирус (TMEV) с помощью быстрой внутричерепного технике инъекций и как очистить лейкоцитов обогащенного населения проникают клетки весь мозг. Короче говоря, мышей анестезировали изофлуран в закрытой камере, и от руки вводят с помощью шприца Гамильтона в лобной коре. Мыши затем убили в разное время после заражения изофлуран передозировки и весь мозг извлекаются и гомогенизировали в RPMI с мясорубки ткани Tenbroeck. Мозг гомогенатах центрифугируют через непрерывный 30% Перколла градиента, чтобы удалить миелина и другой клетке мусора. Клеточной суспензии затем напряженными при 40 мкм, промывают и центрифугируют на разрывной Ficoll-Paque Плюс градиента, чтобы выбрать и очистить лейкоцитов. Лейкоциты, затем промывали и ресуспендировали в соответствующие буферы для иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии. Проточная цитометрия выявляет населения врожденных иммунных клеток на ранних стадиях инфекции в C57BL / 6 мышей. Через 24 часа после инфекции, несколько подмножеств иммунные клетки присутствуют в BILS, с населением обогащенных Gr1 +, CD11b + и F4/80 + клеток. Таким образом, этот метод полезен при характеристике иммунного ответа на острую инфекцию в мозгу.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes at JoVE.com

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Быстрый метод получения проникновения лейкоцитов из мышиного мозга описывается. Этот метод использует непрерывный градиент Перколла и разрывные градиент Ficoll, чтобы выбрать и очистить лейкоцитов обогащенного слоя. Изолированные лейкоцитов может затем быть охарактеризованы с помощью проточной цитометрии измерений.

Выделение Брейн-Лейкоциты проникают

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

isolation-of-brain-infiltrating-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.0K Views.  Mayo Clinic College of Medicine. Быстрый метод получения проникновения лейкоцитов из мышиного мозга описывается. Этот метод использует непрерывный градиент Перколла и разрывные градиент Ficoll, чтобы выбрать и очистить лейкоцитов обогащенного слоя. Изолированные лейкоцитов может затем быть ...

Video: Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Выделение мышью перитонеальных клеток полости

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Выделение функциональных сердечно иммунных клеток

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Выделение и анализ Brain-секвестрированных лейкоцитов из<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-инфицированных мышей

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Биоэнергетика и окислительного: протоколах выделения и оценки человека лейкоцитов и тромбоцитов

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Выделение лейкоцитов из интерфейса человека матери и плода

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Выделение лейкоцитов из мышиного тканей на матери и плода интерфейс

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Выделение Лейкоциты проникают из кожи мыши, используя ферментативные дайджест и Gradient Разделение

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.

Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

Селективный Заготовка Marginating-легочными Лейкоциты

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Селективный Заготовка Marginating-печеночной Лейкоциты

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...