Этот протокол позволяет нам выполнять генетические манипуляции in vivo в ключевой модели животных, что позволяет нам изучать расширение и складывание развивающегося неокортекса. Основным преимуществом этого метода является использование высокой пространственной и временной специфичности в ориентации на те нервные стволовые клетки, которые являются ключевым типом клеток для развития мозга. Перед началом процедуры, тянуть стеклянные капилляры на микро пипетки шкив и использовать типсы, чтобы отрезать дистальной части капилляра, чтобы настроить диаметр капиллярного кончика.
На эмбриональный день 33, добавить соответствующую концентрацию ДНК в PBS, дополненный 0,1%Быстрый зеленый с нежным смешивания, и место 3-часовой пост, анестезировал, беременная самка хорька на столе операции с тепловой площадкой. Подтвердите соответствующий уровень седиации, касаясь периокулярной кожи и щипать кожу между вторым и третьим или третьим и четвертым ног обеих задних конечностей. Изофлюран может вызвать неблагоприятные последствия, в том числе тошноту и головокружение.
При обработке изофлюран в жидком виде используйте защитное оборудование. Во время операции используйте соответствующие канистры для захвата газа. Вводите животному подкожно анальгетики, антибиотики и глюкозу, и поместите мазь на глаза животного.
Используйте клиперы для бритья живота и очистки открытой кожи водой, мылом и раствором йода. Затем высушите кожу марлевыми тампонами и продезинфицируете спиртом и йодными скрабами. Ибо в утробе матери электропорации, место стерильной драпировки над животным и использовать скальпель, чтобы сделать примерно 5-сантиметровый разрез кожи на линии Альба.
Используйте ножницы, чтобы прорезать мышечный слой и разместить марлевых тампонов вокруг места разреза. Влажная марля с PBS и поместите матку на тампоны. Используя пипетку с длинным наконечником, загрузите один из вытянутых стеклянных капилляров с 5 микролитров раствора ДНК на эмбрион, которые будут введены.
Прикрепите загруженную капиллярную часть к держателю и соедините другую сторону держателя с трубкой и мундштуком. Найдите головку первого эмбриона и поместите источник волоконно-оптического света рядом с головой. Используя пигментированную радужную оболочку в качестве точки отсчета, проникайте в кожу, череп и мозговую ткань кончиком стеклянной капиллярной артерии и используйте трубу рта для облегчения доставки 3-5 микролитров инъекционного раствора в желудочек одного из полушарий головного мозга.
Поскольку инъекционный раствор содержит 0,1%Fast Green, успешная инъекция приведет к темно-зеленому окрашивания инъекционного желудочка, который теперь будет виден как почечная структура. После инъекции поместите электроды пинцета на матку над головой эмбриона с положительным полюсом над областью, которая будет направлена и отрицательный полюс ниже вводили области. Установите длину импульса электропората до 50 миллисекунд, импульсное напряжение до 100 вольт, интервал импульса до одной секунды и количество импульсов до пяти.
Когда все параметры будут установлены, нажмите Пульс "и быстро падение несколько капель теплого PBS на электропогрятый эмбрион. Когда все эмбрионы были электропотери, вернуть матку в брюшной полости и использовать 4-0 шва, чтобы закрыть мышечный слой с брюшной полости. Закройте кожу аналогичным образом и накройте рану алюминиевым спреем.
Затем вернуть животное в клетку с источником тепла и мониторинга до полного лежачих. Через четыре дня после электропорации в эмбриональный день 37, большинство целевых клеток и их потомство все еще находятся в зародышевых зонах и клетки редко наблюдаются дальше базально в корковой пластине. Личность прародителя может быть исследована с помощью иммунофторенса для маркеров велосипедных клеток, таких как PCNA, в то время как подмножество прародителей, проходящих митоз, может быть показано маркерами, такими как фосфо-гистон 3.
На послеродовой нулевой день, через восемь дней после электропорации, потомство целевых клеток распространилось на все гистологические слои. Используя комбинацию маркеров транскрипционного фактора, могут быть выявлены различные популяции базальных прародителя. Например, Sox2 является маркером пролиферативных клеток-предшественников, включая базальные радиальные глии.
А белок мозга T-box 2 является маркером нейрогенных базальных прародителей, которые в основном являются промежуточными прародителями. К послеродовому 16-му дню большинство целевых клеток перестают делиться и дифференцироваться на нейроны и глию, при этом хорек послеродового дня 16 неокортекс демонстрирует характерный складной узор. В утробе матери электропорации эмбрионов хорька является чрезвычайно мощным методом для изучения функции генов.
Это позволило нам изучить гены, которые были вовлечены в расширение неокортекса в эволюции, в том числе человеческих генов. И с помощью этого мощного метода, мы действительно смогли выяснить ключевые особенности того, как эволюционное расширение неокортекса человека, вероятно, работал.
