Мы благодарны Lihong Инь для оказания технической помощи. NVD является получателем NARSAD молодых исследователей премии и также при поддержке грантов NIH (5 K99 MH095825-02). Исследования в лаборатории Fishell поддерживается Национальным институтом здравоохранения, Национального института психического здоровья (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Национального института неврологических расстройств и инсульта (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) и Фонд Саймонса.

Все животные были обработаны в соответствии с правилами и руководящими принципами уходу и использованию комитета Институциональная животных из Нью-Йоркского университета Медицинской школы. Mouse Штаммы Швейцарские Webster мышей-самок, предоставляемые Taconic были использованы для этих экспериментов. Для того, чтобы особый акцент поверхностные интернейронов слоя, были использованы эмбрионы E15.5. Примечание: плазмиды, используемый в этой работе (Dlx5 / 6.eGFP плазмиды 3 мкг / мкл), создан с помощью стандартных методов клонирования. EGFP кДНК клонировали в Dlx5 / 6-Pmin-поли плазмиды. Эта плазмида предоставляется по запросу (demarn02@nyumc.org). 1 Подготовка микроинъекции пипетки <ol><li> Установите съемник Heat # 2 по 860. </li><li> Поместите и закрепите стеклянный капилляр около нити. Убедитесь, что наружный диаметр (OD) пипетки примерно 30 мкм. </li><li> Нажмите кнопку &quot;тянуть&quot;. </li><li> Осторожно снимите капилляр. В нижней части находится игла. Откажитесь верхнюю часть. </li></ol> 2 Порядок Анестезия <ol><li> Подготовка ИФ содержащий камеру. Примечание: Isoflurane является предпочтительным анестетик в связи с его быстрым действием и низкой частотой побочных эффектов. Пентобарбитал другой вариант; Однако, терпимость этого препарата является переменной и может привести к более высокому смертности, чем изофлураном. </li><li> Набор поток изофлуран до 4-5%, в 0,5-1 л / мин O 2. </li><li> Убедитесь, что клапан для камеры открыт в то время как клапан для головного адаптера закрыт. </li><li> Поместите беременную мышь в камере. </li><li> Разрешить мышь идти под действием анестезии. Это займет около 2-3 мин. Проверьте частоту дыхания. Если мышь начинает гипервентиляция, снизить дозу изофлураном. </li><li> После мышь анестезии, сразу же снимите его из камеры. Поместите его вентральной стороной вверх на грелку, и яnsert голову в маске, которая будет продолжать поставлять изофлурана всей операции. Убедитесь, чтобы переключить поток изофлураном из камеры с трубкой, соединяющей головы адаптера кусок. Поместите каплю глаз смазки в каждый глаз и закрыть глаза. </li><li> Установите грелку до 36 ° C градусов, чтобы минимизировать переохлаждение. </li><li> Проверьте отсутствие стопы и хвостовых рефлексов, зажимая задние лапы и хвост. </li></ol> 3 хирургии <ol><li> Очистить кожу, покрывающую живота с 70% этанола. </li><li> Используйте пинцет, чтобы вытащить кожу вверх. После каждого хирургии, мыть все инструменты водой с моющим средством, и стерилизовали при 72 ° CO / N. </li><li> Сделать небольшой вертикальный разрез (около 2 см) вдоль средней линии, начиная посередине между третьей и четвертой пар молочных желез. Используйте тонких ножниц хирургии. Позаботьтесь, чтобы не повредить брюшную стенку. </li><li> Аккуратно отделить кожу от брюшины. </li><li> Визуализация артерийи вены на брюшную стенку. Сделайте еще 2 см вертикальный разрез через брюшину (избегая сосуды), чтобы выставить в брюшную полость. </li><li> Зажмите кожу и брюшной стенки с каждой стороны, избегая зажима артерии. Примечание: Если артерии случайно проколот, пожертвовать животное сразу, выполняя шейки дислокации или ИФ передозировки. </li><li> Предварительно нагрейте стерильной PBS до 37 ° С. Обложка зажимы с PBS влажные Ким салфетки. </li><li> Увлажнение подвергается брюшной полости с PBS. Повторите этот шаг несколько раз при выполнении операции. </li><li> Использование круглых щипцов, осторожно потяните эмбрионального цепь (E15.5) от от полости. Пусть цепной отдохнуть на влажных салфеток. Сначала подвергая одну половину матки в первую очередь. После того, как эмбрионы в ней электропорации, вернуть его внутрь, а затем работать на второй половине. </li></ol> 4 Электропорация <ol><li> Продолжайте использовать круглые щипцы для манипулирования эмбрионов. </li><li> Visualize боковые желудочки. Боковые желудочки проходят по средней линии (рисунок 1b). </li><li> Добавить Fast Green (В наличии: 10% вес / объем) в растворе ДНК, 1:20 смеси, чтобы визуализировать его во время инъекции. Готовят раствор ДНК путем растворения осадка, полученного из стандартного протокола очистки препаративной макси-в дистиллированной воде. </li><li> Используйте предварительно вытащил микропипетки с поршнем для введения 1 мл раствора ДНК (Dlx5 / 6-EGFP, 3 мкг / мкл) с Fast Green. Обрежьте кончик микропипетки с тонкой Forcep # 5 (Dumont), чтобы оставить 6 мм длина от начала плеча до конца наконечника иглы перед загрузкой пипетки. Держите голову эмбриона с круглыми пинцетом. Введите мозг с пипетки под углом 45 ° с целью для бокового желудочка расположился в средней линии. Если игла проникает через желудочка, медленно отведите пипетку, как вы используете поршень для введения ДНК. Желудочек станет зеленым, когдарешение начинает заполнять его. В этот момент прекращают движение пипетку и вводят 1 мл ДНК. Аккуратно извлеките пипетки. </li><li> Установите CUY21 электропоратора пяти 45V импульсов 50 мс, разнесенных на 950 мс. </li><li> Используйте 5 мм весла электроды для эмбрионов E15.5. Опустите электроды в PBS для обеспечения эффективного текущую передачу. </li><li> Поместите электрод весла вокруг головы эмбриона с положительным веслом на желудочка, содержащую раствор ДНК. Слегка опустите положительный весло в отношении отрицательного один, чтобы создать вентральной тока через ганглиозных возвышениях. Эта манипуляция позволит свести к минимуму внематочной выражение в пирамидальных клеток. </li><li> После размещения электродов, доставить импульс, нажав на педаль один раз. </li><li> Удалите электроды и протрите их чистой. Повторите шаги 4,6-4,9 с каждого эмбриона. </li><li> После электропорации все эмбрионы, залить 3 мл PBS в брюшную полость и вернуть их в брюшной полости. </li><li>Первый шов брюшной стенки с изогнутым иглы и 5-0 шелковой нити, а затем кожу. Применить Лидокаин (4%) на рану. Администрирование 120 мг / кг аспирина внутри брюшины для обезболивания. Примечание: Вся процедура должна быть выполнена в течение 20 мин или менее. Желательно, чтобы новички только электропорации несколько эмбрионов, чтобы держать короткие время работы. Длительные операции снизится выживаемость эмбрионов. </li><li> Снимите животное из трубки анестезии и позволяют восстановления на грелку на бумаге протрите. </li><li> Возвращение животное в клетку, держать его на грелку при 37 ° С и следить за состоянием здоровья. Животные обычно терпеть операцию хорошо и начинают медленно двигаться только после того как они удаляются из трубки анестезии. Если наблюдается чрезмерное кровотечение или вялость, пожертвовать животное сразу, выполняя IACUC утверждены процедуры эвтаназии, такие как смещения шейных позвонков или анестезии передозировки. </li><li> Вернуться клетку к виватновесие. Женщины будут рожать естественным путем. </li></ol>

<ol>
	<li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon:+&amp;#34;where+the+wild+things+are&amp;#34;.">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &amp;#34;where the wild things are&amp;#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li><li>Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+distinct+progenitor+populations+in+the+lateral+ganglionic+eminence:+implications+for+striatal+and+olfactory+bulb+neurogenesis.">Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis.</a> J Neurosci. 23, 167-174 (2003).</li><li>Eisenstat, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLX-1,+DLX-2,+and+DLX-5+expression+define+distinct+stages+of+basal+forebrain+differentiation.">DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation.</a> J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).</li><li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network.">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).</li><li>Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologically+distinct+temporal+cohorts+of+cortical+interneurons+arise+from+telencephalic+Olig2-expressing+precursors.">Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors.</a> J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).</li><li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons.">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).</li><li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+Dlx-2+(Tes-1)+gene+is+expressed+in+spatially+restricted+domains+of+the+forebrain,+face+and+limbs+in+midgestation+mouse+embryos.">The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos.</a> Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).</li><li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+expression+of+Dlx-1,+Dlx-2+(Tes-1),+Gbx-2,+and+Wnt-3+in+the+embryonic+day+12.5+mouse+forebrain+defines+potential+transverse+and+longitudinal+segmental+boundaries.">Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries.</a> J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).</li><li>Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+expression+of+a+member+of+a+new+family+of+murine+Distal-less+homeobox+genes+in+the+developing+forebrain.">Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain.</a> The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).</li><li>Close, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satb1+is+an+activity-modulated+transcription+factor+required+for+the+terminal+differentiation+and+connectivity+of+medial+ganglionic+eminence-derived+cortical+interneurons.">Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons.</a> J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes.">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Ограничения техники В то время как этот метод позволяет мобильному автономного анализа клеточных процессов, он не подходит для анализа населения. В electroporations очень редкие с менее тысячи клеток электропорации за мозга. Как следствие, этот метод не может быть использован ?...

Основная часть коры интернейронов ГАМКергические происходят из двух переходных эмбриональных структур, названных медиальной и хвостового ганглиозные возвышения (MGE и общего равновесия соответственно) 4. Парвальбумина и соматостатина выражая интернейронов происходят в MGE, тогда Calretinin (Cr), Vasointestinal пептид (VIP) и Reelin (Re) выражая интернейронов происходят из КГЭ. Эти интернейрон подтипов можно отличить по их датах рождения. MGE, полученные подтипы рождаются между эмбриональной день 9.5 (E9.5) и E16.5 5,6. В отличие от этого, КГЭ, полученные интернейронов рождаются из E12.5 через E18.5 с их производство достигнув E15.5 6. Генетический таргетинг этого поздно родился населения, однако, пока не удается. Мышиные дистального-менее (DLX) гены экспрессируется исключительно в развивающихся вентральной части переднего мозга 3. ГАМКергические интернейронов и полосатого тела нейронов разбрасывания, но не корковых пирамидальные клетки выразить Dlx1, 2,5, и 6 генов на ранних стадиях развития 3. В самом деле, гены Dlx выражаются в MGE и КГЭ субвентрикулярной зоне (SVZ) во всех предшественников ГАМКергические. Экспрессия этих генов становится ограниченным, чтобы выбрать подтипы в постмитотических этапах 7-9. Предыдущий экспериментальные доказательства показали, что усилитель элемент Dlx5 / 6 позволяет избирательный подход ГАМКергических линий в трансгенных мышах 2. Мы протестировали использование одного из этих усиливающих элементов в контексте выражение эписомального в развивающемся мозге мыши. Мы суб клонировали энхансер элемент Dlx5 / 6 вместе с минимальным промотором и расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в Bluescript (BS) магистральной плазмиды (рисунок 1). Мы ввели плазмиды с помощью внутриутробно электропорации в E15.5 для селективного воздействия CR-, VIP и повторно подтипов 3,8,10. Наша методика позволяет редкой электропорации, что облегчаетреконструкция морфологических особенностей ожога клеток. Кроме того, исключительно высокие уровни экспрессии генов в нейронах коры ГАМКергические позволяет функциональных исследований. Мы провели потери и усиление функциональных исследований с использованием нескольких дикого типа и доминантных негативных генов 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1106">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:436px;">Electroporator&#160; with pedal</td>
			<td style="width:227px;">Protech International</td>
			<td style="width:164px;">CUY21</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5mm paddle electrodes&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Protech International</td>
			<td style="width:164px;">CUY650P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating pad&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Kent Scientific</td>
			<td>DCT-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:436px;">Sutter Instruments P30 Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>3282322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluovac Anesthesia Systems</td>
			<td>&#160;Harvard Apparatus</td>
			<td>726425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delicate Operating Scissors 4.75&#34; Straight Sharp/Sharp</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>&#160;RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-0 Silk Black Braid 18&#34; C-1 Box 36&#160;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>SUT-1073-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Clip Applying Forceps 5.5&#34;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>&#160;RS-5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 Clamp scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>&#160;RC-4894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Holding forceps&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11031-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillary tubing&#160;</td>
			<td>&#160;FHC</td>
			<td>27-30-0</td>
			<td>Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtype-selective electroporation of cortical interneurons

Изучение центральной нервной системы (ЦНС) созревания зависит от генетической адресности нейронных популяций. Тем не менее, задача ограничивая экспрессию генов, представляющих интерес для конкретных нейрональных подтипов, оказалось на удивление сложным вследствие относительного дефицита конкретных элементов промотора. ГАМКергические интернейронов составляют нейронов население обширных генетических и морфологическое разнообразие. В самом деле, более 11 различных подтипов ГАМК интернейронов были охарактеризованы в коре мыши 1. Здесь мы представляем адаптированный протокол избирательный подход популяций ГАМКергические. Мы достигли подтипа избирательного выбора ГАМКергические интернейронов с помощью энхансерной элемент гомеобоксного транскрипционных факторов Dlx5 и Dlx6, гомологов дрозофилы дистальной-менее (DLL) гена 2,3, для управления экспрессией специфических генов через внутриутробное электропорации.

Мы адаптировали технику электропорации внутриутробно для достижения типа клеток специальными программами со сроком погашения нейронов. Для управления экспрессией EGFP в КГЭ-полученных интернейронов, мы использовали Dlx5 / 6 энхансерный элемент и ограничена наши инъекции E15.5, эт...

Watch this Scientific Journal Video about Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons at JoVE.com

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Класс-селективный Электропорация корковых интернейронов

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

subtype-selective-electroporation-of-cortical-interneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Views.  New York University School of Medicine. This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Video: Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

Внутриутробное Электропорация последующей первичной нейронов культуры для изучения функции генов в Подмножество корковых нейронов

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Функциональной визуализации кальция в развивающихся Корковая сетей

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Выделение и культуры мышь кортикальной астроциты

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Новорожденных субвентрикулярной Electroporation зоны

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Экс внутриутробно электропорации и всего Экспланты полушарии: Простой экспериментальный метод исследования раннего развития коры

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

Неонатальный пиальных поверхности Электропорацию

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Цельноклеточная Записи патч-зажим от Morphologically- и нейрохимически выявленных гиппокампа Интернейроны

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Руководство по<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Регистрация отдельных единиц из Optogenetically Идентифицировано корковых ингибиторной интернейронов

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Электрофизиологические Способ записи ответов внутриклеточный амперных<em&gt; Drosophila</em&gt; Фоторецепторов и Интернейроны к световой раздражитель<em&gt; В Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

Визуализация корковых модулей в плоский млекопитающих коре

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...