Этот протокол обеспечивает уникальный инструмент для генерации и изоляции хламидиоза с измененными профилями развития, в конечном счете, что позволяет идентифицировать гены, которые регулируют цикл развития. Основными преимуществами этого метода являются способность отслеживать развитие хламидиозных клеток в режиме реального времени и способность изолировать хламидиоз, с изменением программ развития. Чтобы мутагенизировать хламидиоз trachomatis репортер, увидел хламидийный запас, содержащий примерно три раза от 10 до седьмого элементарных органов.
Преобразованная с репортером плазмы интереса и гранулы, мысль снабжена центрофугации. использовать sonication на 10%power в течение 10 секунд, чтобы повторно использовать элементарные тела в 100 микролитров случайного буфера метаболизма и разделить в результате элементарной подвески тела поровну, между двумя 1,5 миллилитров микро центрифуги труб. Добавьте 50 микролитров свежеприготовленного раствора метаболизма EMS в хламидиозные алициты для мутагенеза и 50 микролитров буфера вакцидного метаболизма в хламидиальный алицит только для стокового мутагенеза и инкубации обоих образцов в течение 20 минут при комнатной температуре.
EMS является известным канцерогеном носить перчатки во время обработки, и замочить все EMS загрязненного оборудования и среднего, в одном гидроксиде натрия моляра в течение 24 часов до удаления. Создать оптовую культуру, для визуализации и изоляции мутигенизированных трахометров хламидиоза. Семя шесть хорошо стеклянные нижние пластины, с шести раз от 10 до пятого стоимость семь клеток, в двух миллилитров полной среды на колодец и семян 24 хорошо полистирол пластины с 10 до пятой причиной семь клеток в одном миллилитр полной среды на колодец.
Для того чтобы заразить культуру клетки хозяина с mutagenized отрицает trachomatis chlamydia заражает, 5 колодцев стеклянной дном плиты с приблизительно 6 временами от 10 до пятого, mutagenized элементарных тел. В 1,5 миллилитров ледяного HBSS на колодец. и заразить оставшиеся хорошо, примерно в два раза от 10 до пятого макет mutagenized элементарных органов в 1,5 миллилитров ледяной HBSS на колодец, после 15 минут инкубации при 37 градусов по Цельсию, с качания, мыть инфицированных клеток с 37 градусов по Цельсию HBSS дополнены один миллиграмм на миллилитр гепарина, а затем сразу же HBSS.
мыть клетки с гепарином снова, а затем сразу же два полоскания с HBSS только для обеспечения того, чтобы все гепарин удаляется. После последней стирки добавьте четыре миллилитров 37 градусов по Цельсию среды изображения, к каждому хорошо. И заполнить межуголонные пространства с 37 градусов по Цельсию деионизированной воды затем поместить пластины в инкубатор культуры клеток в течение 10 часов.
В конце инкубации установлена стадия микроскопа инкубатора до 5%углекислого газа и 37 градусов по Цельсию. И поместите шесть хорошо стеклянной нижней пластины, в стадии инкубатора. В программном обеспечении для визуализации используйте плагин с высоким содержанием скрининга, чтобы выбрать шаблон из шести хорошо пластин, и создать список позиций изображений, состоящий из 12 полей зрения за хорошо использовать опцию автофокусировки, чтобы установить фокус для автоматизированной визуализации и установить экспозицию до 250 миллисекунд при интенсивности 4% в канале GFB и 18% плотности в канале RFP.
Таким образом, в цикле визуализации в течение 24 часов, с интервалом в 30 минут, чтобы захватить кинетику цикла развития и установить захват изображения, чтобы включить несколько стеков с диапазоном фокуса, который заканчивается по обе стороны от среза InFocus, затем выберите относительный q для визуализации, несколько ломтиков в окне приобретения и используйте опцию файла стека изображений. для настройки изображений, которые будут сохранены в качестве файлов стека TIFF. Для идентификации треков включения, с изменением профилей развития, используйте ячейку импорта на экране EMS, разметку ноутбука Python, чтобы импортировать данные о треке включения из пятен в статистике треков, CSV файлы в кадр данных Panda.
Используйте вычислить ячейку для расчета времени, чтобы иметь максимальное выражение как для ранних, так и для поздних репортеров для каждого трека и использовать пакет построения bokeh, в ячейке участка по половине максимума, чтобы визуализировать время выражения двух половин макс до половины максимального выражения против этого выпускного вечера hctB. Используйте bokeh интерактивный трек ID Explorer, для выявления включений из популяции мутантов, которые выпадают за пределы макета обработанных облако рассеяния. Для визуализации изменений в кинетике выражения промоутера динамически в анимированном графике клеток крови выражение интенсивности EOU выпускного вечера против hctB выпускного вечера.
Затем визуализируете снимок с анимированного графика в ячейке локатора включения. Чтобы изолировать развития Ньютонов, от включений интереса, положение поле зрения над хорошо с выявленным включением, и передать иглу над фазой дифференциала интерференции контраст белого света канал источника света, чтобы визуализировать иглу, использовать 595 нанометров, возбуждение канала, чтобы визуализировать элементарные тела для извлечения. И использовать тонкую регулировку и микро-манипулятор, чтобы маневрировать капиллярной иглы к включению, разрыв включения с иглой, и использовать микро инжектор, чтобы привлечь элементарные тела в кончик капиллярной иглы.
Изгнать извлеченные элементарные тела, из капиллярной иглы в один колодец, из подготовленных на 24 хорошо полистирол пластины, и использовать новую капиллярную иглу для следующего извлечения. После достаточного расширения каждого изолята, нарушить инфицированных монослой с одним миллилитров микропайпер кончиком и передачи среднего клеточного мусора и выпустила хламидиоз в новый 1,5 миллилитр микроцентрифуг трубки. Пеллет собранных хламидиоза центрифугации, и повторно гранулы в 75 микролитров ледяной, сахароза фосфат глутамат буфера, а затем разделить включение подвески поровну, между тремя новыми 1,5 миллилитров винт крышка микро центрифуг трубки, и хранить трубки на уровне минус 80 читать по Цельсию.
Для настройки культуры клетки-хозяина для визуализации мутагена ISED изолирует семена 96 хорошо стеклянной нижней пластины с 1,6 раза от 10 до четвертой стоимости семь клеток, в 100 микролитров полной среды на колодец. После того, как монослой клетки-хозяина достигает слияния оттепели, собранные клоны мутантов и запасы хламидиоза дикого типа на льду и используют одну колонку на изолят для выполнения, двукратный серийный разбавления каждого мутанта изолята. Заразить, оставшийся столбец с дикого типа хламидиоза, при множественности инфекции около 0,5, и место пластины в инкубаторе культуры клеток в течение 10 часов в конце инкубации, выберите три скважины на мутант изолировать, которые соответствуют множественности инфекции менее одного, и создать список изображений позиции.
состоящий из двух полей зрения на колодец. В этом scatterplot, время до половины максимального выражения EOU и hctB промоутеров из отдельных хламидиальных изолятов можно наблюдать клонов A3667 и B3858 был избран для изоляции, поскольку они производятся короткие времена, чтобы иметь максимальное выражение, от EOU промоутер и больше раз четыре hctB. Включения с измененной кинетикой могут быть идентифицированы на основе визуализации, динамической экспрессии генов двух промоутеров, и снимок анимированного графика может быть использован, чтобы определить местоположение включений, представляющих интерес.
В этих репрезентативных визуализаций, в общей сложности 24 включений были определены для изоляции, 10 из которых выставлены дифференциальной кинетики, при повторном тестировании в трех различных фенотипических категорий, восемь изолятов выставлены снижение EOU промоутер выражение примерно в 24 часов после заражения. Как показал клон A3667, изолят B3858, также выставлены снижение EOU промоутер выражение, примерно в 24 часов после заражения. Но общее увеличение hctB промоутер выражение, в то время как B3662 изолировать, выразил повышенный уровень florescence от EOU промоутер следуют внезапная потеря выражения в обоих промоутеров.
Анализ микрографов живых клеток для мутанта B3662, показывает, что лиз клеток-хозяина произошел, в клетках, инфицированных этим мутантом, гораздо раньше, чем в диких инфицированных клетках типа. Развитие типа клетки недостаточное восстановление хламидиоза, не может быть возможным, так как эти клетки не могут повторно заразить хозяина. Геном широкие исследования ассоциации могут быть использованы после изоляции, для выявления генов развития, через статистическую корреляцию, с включением альтернативных репортеров промоутер.
Этот метод может быть расширен, для зондирования многочисленных генетических путей, в вскрытии генетических механизмов цепи, и других внутриклеточных патогенов.
