Este protocolo proporciona una herramienta única para la generación y aislamiento de chlamydia con perfiles de desarrollo alterados, permitiendo en última instancia la identificación de los genes que regulan el ciclo de desarrollo. Las principales ventajas de este método son la capacidad de rastrear el desarrollo del tipo de célula de clamidia en tiempo real y la capacidad de aislar la clamidia, con programas de desarrollo alterados. Para mutagenizar a un reportero de clamidia trachomatis, vio un stock de clamidia que contenía aproximadamente tres veces el décimo a los séptimos cuerpos elementales.
Transformado con el plasma reportero de interés y pellet, el pensamiento se siembra por centrofugación. utilizar la sonicación a 10% de potencia durante 10 segundos, para resuspender los cuerpos elementales en 100 microlitros de tampón de metabolismo accidental y dividir la suspensión elemental resultante del cuerpo por igual, entre dos tubos de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Añadir 50 microlitros de solución de metabolismo EMS recién preparada en las alícuotas de clamidia para mutagénesis y 50 microlitros de tampones del metabolismo vaccicín a la alícuota clamidial sólo para mutagénesis de stock e incubar ambas muestras durante 20 minutos, a temperatura ambiente.
EMS es un guante de desgaste carcinógeno conocido durante la manipulación, y remoje todo el equipo contaminado con EMS y medio, en un hidróxido de sodio molar durante 24 horas antes de su eliminación. Establecer un cultivo al por mayor, para la toma de imágenes y el aislamiento de los tracómetros de clamidia mutigenizados. Las placas inferiores de seis pozos de semillas, con seis veces 10 a la quinta, cuestan siete células, en dos mililitros de medio completo por pozo y siembran una placa de poliestireno de 24 pozos con 10 a la quinta causa siete células en un mililitro de medio completo por pozo.
Para infectar el cultivo de la célula huésped con negaciones mutagenizadas chlamydia trachomatis infect, cinco Pozos de una placa de fondo de vidrio con aproximadamente seis veces 10 a la quinta, de cuerpos elementales mutagenizados. En 1,5 mililitros de HBSS helado por pozo. e infectar el pozo restante, con aproximadamente dos veces 10 a la quinta simulacro de cuerpos elementales mutagenizados en 1,5 mililitros de hielo frío HBSS por pozo, después de una incubación de 15 minutos a 37 grados Celsius, con balanceo, lavar las células infectadas con 37 grados Celsius HBSS complementado con un miligramo por mililitro de heparina, seguido inmediatamente por un enjuague HBS.
lavar las células con heparina de nuevo, seguido inmediatamente por dos enjuagues con HBSS solo para asegurarse de que se retira toda la heparina. Después del último lavado, agregue cuatro mililitros de 37 grados Celsius de medio de imagen, a cada pozo. Y llene los espacios entre pozos con 37 grados Celsius desionized water luego coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante 10 horas.
Al final de la incubación, la incubadora de la etapa del microscopio se desprendió de 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados. Y coloque la placa inferior de seis vasos, en la incubadora del escenario. En el software de imágenes, Utilice el plugin de cribado de alto contenido para seleccionar la plantilla de placa de seis pozos y generar una lista de posiciones de imagen que consta de 12 campos de visión por pozo, utilice la opción de enfoque automático para establecer el enfoque de la imagen automatizada y establezca la exposición en 250 milisegundos a una intensidad del 4% en el canal GFB y un 18% de densidad en el canal RFP.
Por lo tanto, en el ciclo de imágenes durante 24 horas, con intervalos de 30 minutos, para capturar la cinética del ciclo de desarrollo y establecer la captura de imagen para incluir varias pilas Z con un rango de enfoque que termina a cada lado del sector InFocus, luego seleccione Z relativa para imágenes, varios sectores en la ventana de adquisición y utilice la opción de archivo de pila de imágenes. para configurar las imágenes que se guardarán como archivos de pila TIFF. Para identificar pistas de inclusión, con alter perfiles de desarrollo, utilice la celda de importación en la pantalla emS, rebaja el bloc de notas de Python, para importar los datos de seguimiento de inclusión de los puntos en las estadísticas de pista, archivos CSV en el marco de datos de Panda.
Utilice la celda calcular para calcular el tiempo para tener la expresión máxima para los reporteros tempranos y tardíos para cada pista y utilice el paquete de trazado bokeh, en la celda de trazado medio máximo, para visualizar el tiempo dos expresión media máxima a la expresión media máxima contra la de hctB prom. Utilice el Explorador de ID de pista interactiva bokeh, para identificar inclusiones de la población mutante, que están fuera de la nube de dispersión tratada simulada. Para visualizar los cambios en la expresión del promotor cinética dinámicamente en el gráfico de células sanguíneas animadas, las intensidades de expresión de EOU prom contra hctB prom.
A continuación, visualice una instantánea desde el gráfico animado, en la celda del localizador de inclusión. Para aislar el desarrollo Newtons, de las inclusiones de interés, posicionar el campo de visión sobre un pozo con una inclusión identificada, y pasar la aguja sobre la fuente de luz de canal de luz blanca de contraste de interferencia diferencial de fase, para visualizar la aguja, utilizar el 595 nanómetro, canal de excitación, para visualizar los cuerpos elementales para la extracción. Y utilizar el ajuste fino y el micro manipulador, para maniobrar la aguja capilar a la inclusión, romper la inclusión con la aguja, y utilizar el micro inyector para dibujar los cuerpos elementales en la punta de la aguja capilar.
Expulsar los cuerpos elementales extraídos, de la aguja capilar en un solo pozo, de la placa de poliestireno de 24 pocillos, y utilizar una nueva aguja capilar para la siguiente extracción. Después de una expansión suficiente de cada aislado, interrumpa la monocapa infectada con una punta de micropipet de un mililitro y transfiera los desechos de células medias y la clamidia liberada en un nuevo tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitros. Pelecilar la clamidia cosechada por centrifugación, y resuspender el pellet en 75 microlitros de hielo frío, tamampón de glutamato de fosfato de sacarosa, luego dividir la suspensión de inclusión por igual, entre tres nuevos tubos micro centrífugos de tapa de tornillo de 1,5 mililitros, y almacenar los tubos en menos 80 para leer Celsius.
Para establecer un cultivo de células huésped para la toma de imágenes de mutagen ISED aísla la semilla de una placa inferior de vidrio de 96 pozos con 1,6 veces 10 al cuarto costo siete células, en 100 microlitros de medio completo por pozo. Después de que la monocapa de células anfitrionas alcance el descongelación de la confluencia, los clones mutantes cosechados y las poblaciones de clamidia de tipo salvaje sobre hielo y utilicen una columna por aislado para realizar, una dilución serial dos veces de cada aislado mutante. Infectar, la columna restante con clamidia de tipo salvaje, en una multiplicidad de infección de aproximadamente 0,5, y colocar una placa en la incubadora de cultivo celular durante 10 horas al final de la incubación, seleccionar tres pozos por aislado mutante que corresponden a una multiplicidad de infección de menos de uno, y generar una lista de posición de imagen.
que consiste en dos campos de visión por pozo. En esta gráfica de dispersión, el tiempo a la media expresión máxima de los promotores de EOU y hctB a partir de aislados clamidiales individuales se puede observar clones A3667 y B3858 fue elegido para el aislamiento, ya que produjeron tiempos más cortos para tener la expresión máxima, del promotor EOU y más tiempo cuatro hctB. Las inclusiones con cinética alterada se pueden identificar en función de la visualización, de la expresión génica dinámica de los dos promotores, y se puede utilizar una instantánea del gráfico animado, para identificar la ubicación de las inclusiones de interés.
En estas visualizaciones representativas, se identificaron un total de 24 inclusiones para el aislamiento, 10 de las cuales presentaban cinética diferencial, tras volver a realizar pruebas en tres categorías fenotípicas diferentes, ocho aislados mostraron una disminución de la expresión promotora de la EOU a aproximadamente 24 horas después de la infección. Como lo demuestra el clon A3667, el aislado B3858, también exhibió una disminución de la expresión promotora de EOU, a unas 24 horas después de la infección. Pero un aumento general en la expresión del promotor de hctB, mientras que el aislado B3662, expresó mayores niveles de florescencia del promotor de la EOU seguido de una repentina pérdida de expresión en ambos promotores.
El análisis de los micrografías de células vivas para el mutante B3662, revela que la lelisis de la célula huésped ocurrió, en células infectadas con este mutante, mucho antes que en las células infectadas de tipo salvaje. El desarrollo de la célula deficienciada de la clamidia, puede no ser posible, ya que estas células no pueden reinfectar al huésped. Los estudios de asociación del genoma se pueden utilizar después del aislamiento, para identificar genes del desarrollo, a través de la correlación estadística, con la incorporación de reporteros promotores alternativos.
Este método puede extenderse, al sondeo de numerosas vías genéticas, a la disección de mecanismos de circuito genético, y otros patógenos intracelulares.
