이 프로토콜은 변경된 발달 단면도를 가진 Chlamydia의 생성 그리고 격리를 위한 유일한 공구를, 궁극적으로 발달 주기를 통제하는 유전자의 확인을 허용합니다. 이 방법의 주요 장점은 클라미디아 세포 유형 개발을 실시간으로 추적하는 능력과 클라미디아를 분리하는 능력입니다. 클라미디아 트라코마티스 리포터를 돌연변이시키기 위해, 제7초등학교에 약 3배 10번을 함유한 클라미얼 스톡을 보았다.
관심과 펠릿의 기자 플라즈마로 변환, 생각은 센트로 푸징에 의해 재고된다. 10초 동안 10%의 전력으로 초음파 처리를 사용하여 100마이크로리터의 초등체를 재보습하고 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관 사이에서 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관 사이에서 1.5밀리리터 마이크로 원심분리튜브 사이에 1.5밀리리터 마이크로 원심분리튜브를 균등하게 분할한다. 새로 준비된 EMS 대사 용액 50마이크로리터를 클라미디아 알리쿼트에 넣고, 50마이크로리터의 암시대사 버퍼를 클라미온 알리쿼트에 첨가하여 주 돌연변이 발생을 위해서만 클라미온 알리쿼트에 넣고 실온에서 20분 동안 두 샘플을 배양합니다.
EMS는 처리 중에 알려진 발암 물질 마모 장갑으로, 모든 EMS 오염 된 장비 및 매체를 폐기 하기 전에 24 시간 동안 하나의 어금니 나트륨 수산화물에 담급니다. 도매 문화를 설정하려면, 절단 된 클라미디아 trachometer의 이미징 및 격리를 위해. 6 개의 잘 유리 바닥 플레이트, 6 번 10 에서 다섯 번째 비용 7 세포, 잘 당 완전한 배지의 두 밀리리터와 씨앗 24 잘 폴리스티렌 플레이트 와 10 에 다섯 번째는 잘 당 완전한 매체의 하나의 밀리리터에 일곱 세포를 발생.
숙주 세포 배양을 돌연변이된 클라미디아 트라코마티스 감염거부로 감염시키기 위해, 유리 바닥판 5개 웰을 약 6배에서 5분의 1로, 돌연변이된 초등학교 체의 감염시켰다. 잘 당 얼음 차가운 HBSS의 1.5 밀리리터에서. 나머지 우물을 감염시키고, 5분의 모의 돌연변이 초등학교 10개에 1.5밀리리터의 얼음냉이 HBSS를 잘 감염시키고, 37°C에서 15분 동안 잠복한 후, 감염된 세포를 37°C의 섭씨로 씻어 내고, 감염된 세포를 헤파린의 밀리그램 당 1밀리그램으로 보충한 후, 즉시 HBS에 의해 뒤따랐다.
헤파린으로 세포를 다시 씻고, 모든 헤파린을 제거하기 위해 HBSS만으로 두 개의 헹구기를 즉시 씻어 내십시오. 마지막 세척 후, 각 우물에 섭씨 37도 이미징 매체의 4 밀리리터를 추가합니다. 그리고 37섭씨 산화물로 우물 간 공간을 채운 다음 10시간 동안 세포 배양 배양 인큐베이터에 판을 놓습니다.
인큐베이션의 끝에서 현미경 단계 인큐베이터는 이산화탄소 5 % 및 섭씨 37도로 설정합니다. 그리고 여섯 개의 잘 유리 바닥 판을 무대 인큐베이터에 넣습니다. 이미징 소프트웨어에서, 고함량 스크리닝 플러그인을 사용하여 6개의 웰 플레이트 템플릿을 선택하고, 자동 초점 옵션을 잘 사용하여 자동 초점 옵션을 사용하여 자동 이미징에 초점을 맞추고 GFB 채널의 4%강도와 RFP 채널의 밀도18%로 노출을 설정합니다.
따라서 30분 간격으로 24시간 동안 이미징 주기에서 개발 주기의 역학을 캡처하고 InFocus 슬라이스의 양쪽에서 끝나는 초점 범위가 있는 여러 Z 스택을 포함하도록 이미지 캡처를 설정한 다음 이미징을 위한 상대 Z, 수집 창에서 여러 조각을 선택하고 이미지 스택 파일 옵션을 사용합니다. TIFF 스택 파일로 저장할 이미지를 설정합니다. 개발 프로파일변경과 함께 포함 트랙을 식별하려면 EMS 화면의 가져오기 셀인 마크다운 파이썬 노트북을 사용하여 트랙 통계의 스팟에서 포함된 트랙 데이터를 가져오려면 CSV 파일을 팬더의 데이터 프레임으로 가져옵니다.
계산 셀을 사용하여 각 트랙의 초기 및 후반 기자 모두에 대한 최대 식을 갖는 시간을 계산하고 하프 최대 플롯 셀에서 보케 플로팅 패키지를 사용하여 hctB 무도회에 대해 절반 최대 식으로 시간을 시각화합니다. 보케 인터랙티브 트랙 ID 탐색기를 사용하여 모의 처리 된 분산 구름 외부에 있는 돌연변이 모집단의 포함을 식별합니다. 프로모터 발현 운동제의 변화를 동적으로 시각화하기 위해 애니메이션 된 혈액 세포 그래프에서 HctB 무도회에 대한 EOU 무도회의 발현 강도.
그런 다음 포함 로케이터 셀에서 애니메이션 그래프에서 스냅샷을 시각화합니다. 발달 뉴턴을 격리하기 위해, 관심의 포함으로부터, 확인된 포함으로 시야를 잘 배치하고, 위상 차동 간섭 대조 백색광채널 광원을 통해 바늘을 전달하여 바늘을 시각화하고, 595 나노미터, 여기 채널을 사용하여 추출을 위한 초등체를 시각화한다. 미세 조정 및 마이크로 조작기를 사용하여 모세관 바늘을 포함시키고, 바늘로 포함을 파열시키고, 마이크로 인젝터를 사용하여 초등학교를 모세혈관 바늘 팁으로 끌어들인다.
추출된 초등학교 체체를 모세관 바늘에서 단 하나의 우물로 추방하고, 24개의 잘 폴리스티렌 플레이트에서 제조된, 다음 추출을 위해 새로운 모세관 바늘을 사용한다. 각 분리의 충분한 확장 후, 1 밀리리터 마이크로 파이프 팁으로 감염된 단층부를 방해하고 중간 세포 파편을 전송하고 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 클라미디아를 방출. 원심분리에 의해 수확된 클라미디아를 펠릿과 75마이크로리터의 얼음 냉기, 자당 인산염 글루타민트 버퍼로 환원한 다음, 3개의 새로운 1.5 밀리리터 스크류 캡 마이크로 원심분리튜브 사이에 포함 현탁액을 균등하게 분할하고, 영하 80에 튜브를 저장하여 섭씨까지 보관한다.
돌연변이원 ISED의 이미징을 위한 숙주 세포 배양을 설정하기 위해 종자 96개의 잘 유리 바닥 플레이트를 1.6배 10배, 제4의 비용으로 7개의 세포에, 100마이크로리터당 완전한 배지의 마이크로리터가 있다. 숙주 세포 단층이 합류에 도달하면 수확된 돌연변이 클론과 야생형 클라미디아 스톡을 얼음위에 해동시키고 격리당 하나의 컬럼을 사용하여 각 돌연변이 분리의 2배 연속 희석을 수행합니다. 감염, 야생형 클라미디아를 가진 나머지 컬럼은 약 0.5의 감염의 복합성에서, 인큐베이션의 끝에 10시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 판을 놓고, 하나 미만의 감염의 복합성에 해당하는 돌연변이 분리물당 3개의 우물을 선택하고, 이미징 위치 목록을 생성한다.
잘 볼 수있는 두 개의 필드로 구성되어 있습니다. 이 산란도에서, 개별 클라미다이얼 분리물로부터 EOU 및 hctB 프로모터의 절반 최대 발현을 관찰할 수 있는 시간은 EOU 프로모터로부터 최대발현을 갖는 짧은 시간을 생성함에 따라 격리를 위해 선출된다. 변경된 운동학을 가진 포함은 2개의 프로모터의 동적 유전자 발현의 시각화, 및 애니메이션 그래프의 스냅샷을 사용하여 관심 있는 포함물의 위치를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 대표적인 시각화에서, 총 24개의 포함물이 격리를 위해 확인되었으며, 그 중 10개는 3개의 다른 표현성 범주에서 재검사를 통해 차동 운동제를 나타내었으며, 8개의 분리는 감염 후 약 24시간에서 EOU 프로모터 발현이 감소하였다. A3667 클론에 의해 입증된 바와 같이, B3858 격리는 또한 감염 후 약 24시간에서 감소된 EOU 프로모터 발현을 나타냈다. 그러나 B3662가 분리된 반면, hctB 프로모터 발기인 표현의 전반적인 증가는 EOU 프로모터로부터 의 증가된 수준의 꽃을 표현한 다음 두 프로모터모두에서 급격한 발현 손실이 나타났습니다.
돌연변이 B3662에 대한 살아있는 세포 현미경의 분석은, 호스트 세포 용해가 이 돌연변이에 감염된 세포에서, 야생 모형 감염한 세포에서 보다는 훨씬 일찍 일어났다는 것을 보여줍니다. 세포 유형 개발 결핍 클라미디아 복구, 이러한 세포가 숙주를 재감염 할 수 없습니다으로, 가능하지 않을 수 있습니다. 게놈 넓은 협회 연구는 대체 프로모터 기자의 통합과 함께, 통계적 상관 관계를 통해 발달 유전자를 식별하기 위해 격리 후 사용할 수 있습니다.
이 방법은 수많은 유전 적 경로의 탐구, 유전 회로 메커니즘 및 기타 세포 내 병원체의 해부로 확장 될 수 있습니다.
