Представленный здесь протокол уменьшает чрезмерные гипоксические повреждения при подготовке взрослых и стареющих ломтиков гиппокампа мыши, тем самым устраняя серьезное препятствие для изучения функции зрелых и стареющих нейронных цепей. Введение гипотермии в растворы без натрия приводит к гиппокампа ломтики, которые являются здоровыми на срок до 10 часов после резки и подходит как для долгосрочных полевых записей и патч-зажим исследований. Этот метод подготовки ломтиков гиппокампа может быть особенно актуален для животных моделей при нейродегенеративных заболеваниях, которые по определению требуют старения мозга подготовки.
Наиболее важным шагом в этом протоколе является введение гипотермии через транскардиальное изобилие с ледяным раствором. С некоторой практикой, исследователи смогут надежно выполнить этот шаг. Начните с подготовки одного литра решения aCSF для восстановительной камеры и последующих записей.
Затем приготовьте 300 миллилитров NMDG-aCSF для транскардиального изобилия и резки шагов. Поместите вибрирующий микротомный режущей лоток и монтажный диск в морозильную камеру минус 20 градусов по Цельсию. Чтобы подготовить камеру восстановления, заполнить его чуть выше ломтик проведения сетки и начать пузырек поддержанию камеры на скамейке при комнатной температуре.
Охладите все 300 миллилитров NMDG-aCSF в морозильной камере, пока кристаллы льда не начнут образовываться на поверхности и стенах бутылки. Поместите бутылку с охлажденным и NMDG-aCSF на лед и пузырь его, сохраняя раствор между нулем и двумя градусами по Цельсию. Возьмите ткань монтажный диск из морозильной камеры и протрите его сухим, если это необходимо.
Вырежьте блок 5%agar размером с мозг мыши и клей его в центре диска с помощью тонкого слоя клея цианоакрилата. Поместите диск с клееным агаром на лед и накройте его бумажными полотенцами до готовности к использованию. Возьмите режущие лоток из морозильной камеры, поместите его в микротом, а затем окружить его льдом и загрузить лезвие.
Подготовь все инструменты заранее для вскрытия мозга. Настройка перистальтического насоса для перфузии транскардиала. Вставьте одну сторону трубки насоса в бутылку со льдом NMDG-aCSF и подходят с другой стороны с 27 калибровочной иглой.
Установите скорость насоса примерно до 3,5 миллилитров в минуту. При такой скорости отток NMDG-aCSF является быстрым путешествием, а не непрерывным потоком. Поместите мышь на спину на подгузник.
Прежде чем продолжить, подтвердил, что мышь находится на хирургической плоскости анестезии, выполняя щепотку ноша. Мышь должна быть безответной, а затем лентой вниз его передние и задние ноги, так что грудь и живот подвергаются. Вырежьте большой участок кожи на груди, переходя из-под грудины в горло.
Захватите грудину миппами, поднимите ее осторожно и начните прорезать грудную клетку с обеих сторон до тех пор, пока грудная полость не будет выставлена. Вырезать через диафрагму, оставляя лоскут грудной клетки прилагается через тонкий кусок мышцы. Следует иметь возможность отложить его в сторону, не имея его упасть обратно на открытые грудной полости.
Убедитесь, что сердце все еще бьется и убедитесь, что большая часть печени видна. Вставьте иглу в левый желудочек, который выглядит светлее по цвету, чем правый. Чтобы стабилизировать иглу, прогнать его через оставшиеся ребра на левой стороне тела.
Найдите темно-красный правый атриум и прорежьте его маленькими ножницами. Кровь должна начать вытекать. Запустите насос и наблюдайте за печенью, которая изменит цвет с красного на коричневый.
Мониторинг цвета печени и продолжать перфузии, пока печень становится бледно-коричневый. Запустите насос еще на несколько минут. Температура тела животного должна упасть до 28-29 градусов по Цельсию, а нос должен быть холодным на ощупь.
Обезглавить мышь с большими ножницами обезглавливание, а затем использовать скальпель с номером 10 лезвие, чтобы разрезать кожу на верхней части черепа. С небольшими ножницами под углом, вырезать череп в средней линии. Далее, используйте миппы номер три, чтобы вырвать правую и левую половинки черепа, будьте осторожны, чтобы забрать дуру с собой.
Удалите мозг, который должен быть небелого цвета, черпая его с помощью шпателя и падение его в NMDG-ACSF решение на льду. Оставьте его там на минуту. Вывихи мозг из NMDG-aCSF и поместите его на лист фильтровальной бумаги.
Вырезать и удалить 60 градусов клин ткани с 60 градусов инструмент по центру в средней линии от рострального конца forebrain. Используйте разрезанные стороны монтажной поверхности, поскольку она обеспечивает надлежащий угол для ломтиков гиппокампа. Разделите полушария вниз по средней линии скальпелем и приклейте их к монтажу диска.
Возьмите монтажный диск со льда и протрите его сухим, если это необходимо. Затем приклейте каждое полушарие перед агар-блоком, срежьте сторону вниз. Убедитесь, что брюшной стороны обоих полушарий касаются агар-блока и что спинные стороны обоих полушарий обращены к лезвию.
При склеив на разрезе стороны, каждое полушарие должно быть ориентировано по отношению к лезвию таким образом, что обеспечивает поперечные ломтики спинного гиппокампа на месте. Погрузите диск с полушариями в режущую камеру, содержащую ледяной карбогенный NMDG-aCSF. Вырезать 400 микрометровый раздел, а затем использовать одноразовые передачи пипетки с наконечником отсечения для передачи ломтик в камеру восстановления, содержащую карбогенированные NMDG-aCSF при комнатной температуре.
Продолжить резки остальных разделов и передачи их в камеру восстановления занимает не более 10 минут, чтобы сократить в общей сложности от восьми до 10 ломтиков из спинного гиппокампа области. Инкубировать ломтики при комнатной температуре в течение примерно двух часов до записи. Этот протокол был использован для создания ломтиков гиппокампа от взрослых мышей.
Большое количество пирамидальных клеток в поле CA1 и субикулум появляются в низком контрасте, отличительной чертой здоровых клеток, когда наблюдается под инфракрасным дифференциалом контрастной микроскопии. Записи патч-зажима можно получить из нейронов CA1 мышей, которые старше шести месяцев. В примере эксперимента здесь, частота миниатюрных возбуждательных постсинаптических течений была измерена после NMDA-LTD был вызван по отношению к условиям контроля.
Частота миниатюрных возбудительных постсинаптических течений была ниже в нейронах после индукции NMDA-LTD, что указывает на зависимость активности синопсисов в CA1. Изменений амплитуды обнаружено не было. Во время записей mEPSC, клетки CA1 были также заполнены биоцитиным и нетронутыми дендритной беседкой и здоровой клеточной привычкой пирамидальных нейронов можно увидеть здесь.
Надежное распределение флуоресцентного красителя по всей клетке позволяет проводить анализ дендритов и дендритных шипов в различных условиях. Долгосрочная потенция, или LTP, синапсов CA3-CA1 примерно 170%, была отмечена, предполагая, что поддержание сигнальных каскадов, необходимых для LTP присутствует в ломтиках, подготовленных из взрослых мышей. Надежный полевой возбуждающей постсинаптический потенциальный сигнал говорит о том, что сетевая связь также сохранилась.
Двумя важнейшими аспектами протокола являются транскардиальное изобилие с ледяным раствором для индуцирования гипотермии и введение NMDG в качестве заменителя ионов натрия в растворах для предотвращения цитотоксического отека. Используя эти меры предосторожности, острые ломтики могут быть подготовлены из любой области мозга. Кроме того, ломтики, приготовленные таким образом, могут быть использованы для визуализации кальция и напряжения с помощью двух-фотонной или широкой микроскопии.
Этот протокол может послужить основой для стандартизированной подготовки к острым ломтикам гиппокампа от стареющих животных и тем самым облегчить сравнение между исследованиями в контексте механизмов нейродегенеративных заболеваний.
