Наш протокол использует анализ одной частицы для мониторинга динамики местоположения и ориентации и характеризует диффузию золотых нанородов на клеточных мембранах. Используя этот метод, можно получить как трансляционную, так и вращательно-динамическую динамику золотых нанородов, а также всесторонне проанализировать динамику и преподносить ее. Этот протокол может быть использован для изучения других типов сложных биологических систем.
Начните с сжигания этанола окунутый стеклянный крышку на пламя и размещение крышки в 35 на 10 миллиметров клеточной культуры блюдо, содержащее два миллилитров клеточной культуры среды без фенола красный. Добавьте 50 микролитров клеточной подвески интереса на крышку и аккуратно встряхните блюдо вперед и назад и влево и вправо, чтобы равномерно распределить клетки. Поместите блюдо в инкубатор клеточной культуры в течение примерно 12 часов, пока клетки не достигнут 20-40%-ного слияния, прежде чем добавить в блюдо 20 микролитров нанородов CTAB с покрытием золота.
После нежной тряски, чтобы равномерно разогнать нанороды по всему блюду, поместите блюдо во увлажненную атмосферу в течение пяти минут. В конце инкубации, медленно перенесите 100 микролитров супернатанта из блюда в паз стеклянной горки и аккуратно поместите сторону клетки крышки вниз на слайд паз, затем запечатайте край крышки лаком для ногтей и дайте лаку для ногтей высохнуть перед размещением слайда на стадии микроскопа темного поля. Для отслеживания отдельных частиц с помощью микроскопии темного поля поместите каплю масла на конденсатор темного поля и поверните ручку до тех пор, пока конденсатор не свяжется со стеклянной горкой.
Поместите каплю масла на верхнюю часть крышки стекла и поверните фокусировку ручку до 60X нефти погружения цель касается масла. Включите источник света и слегка поверните фокусировку ручки, чтобы сфокусировать плоскость изображения. Затем нажмите значок камеры в программном обеспечении микроскопа, чтобы записать образец рассеяния светового изображения с помощью цветной камеры CMOS и сохранить изображение в формате TIFF.
Чтобы извлечь одну долгосрочную траекторию, откройте изображение в ImageJ и нажмите изображение, введите и 8-битный для преобразования изображения из режима RGB в 8-битный режим. Чтобы настроить контраст, нажмите на изображение, отрегулируйте, контрастность яркости и установите параметры. Выберите целевую частицу и используйте Control X, чтобы отрезать фон тайм-ряда.
Нажмите плагины, частицы трекер классический, и частицы трекер, чтобы открыть обнаружение частиц и частиц, связывающих окно и установить радиус до шести, отсечения до нуля, и процентиль до 0,01%Установить диапазон ссылок до 10 и смещения до 10 и нажмите OK, чтобы открыть окно результатов трекер частиц, чтобы увидеть результаты. Нажмите визуализировать все траектории для проверки генерируемых траекторий. Если программное обеспечение генерируется траектории и траектории движения золотых нанородов совпадают, нажмите сохранить полный отчет, чтобы сохранить результаты.
Если генерируемая программным обеспечением траектория не соответствует траектории движения золотых нанородов, щелкните частицы пересылки для повторной связи обнаруженных частиц с различным диапазоном ссылок и параметрами процентиля. Чтобы найти центральную пиксельную координату золотого нанорода в каждом кадре в соответствии с координатами XY, используйте ксикоординацию. м функции.
Чтобы разграничить матрицу из трех на три пикселя, извлечь девять значений интенсивности рассеяния красных или зеленых каналов и рассчитать среднее значение, используйте rgextraction. м функции. Затем используйте поляризацию.
m функция для расчета полярных углов с помощью метода дифференциала двойного канала. Для расчета динамических параметров с помощью формул в таблице запустите два сценария анализа. Для визуального анализа траектории установите координаты X как X, Y координируйте как Y, и время, как Y, затем нажмите на участок, рассеяние и цветную карту, установите параметры графика и добавьте цветовую планку.
Для генерации средних цифр интервала времени перемещения квадрата установите интервал времени как X и среднее квадратное смещение как Y.Click участок, рассеяние, анализ, фитинг, нелинейная установка кривой и открытый диалог и установите параметры графика. Для многочастицового статистического анализа установите динамические параметры интереса как Y и нажмите на участок и гистограмму. Дважды нажмите на гистограмму, чтобы установить размер деления или количество делений и нажмите применить.
Затем добавьте столбец и установите параметры графика. Для анализа тайм-рядов установите время в качестве параметров X и тайм-рядов, такие как Y.Click plot, multi-pane и стек. В всплывающем окне выберите строку и ОК. Затем установите параметры для графика.
Продольный плазмонный максимум 40 на 85 нанометров CTAB покрытием золотых нанородов составляет около 650 нанометров и поперечный резонанс составляет 520 нанометров. Интенсивность рассеяния нанородов CTAB с покрытием золота на клеточных мембранах U87 демонстрирует типичное гауссийское распределение с узкой шириной, в соответствии с нанородами CTAB с покрытием золота на стекле, что указывает на то, что нанороды CTAB с покрытием, отслеживаемые в этом эксперименте, хорошо монодисперсны. Как показано на примере, более 500 траекторий нанородного слоя CTAB с покрытием золота можно отслеживать с помощью микроскопии темного поля и можно разделить на траектории диффузии дальнего действия и ограниченные траектории диффузии.
Радиус gyration всех 500 траекторий в этом репрезентативном анализе показал небольшое распределение значения со средним радиусом gyration 0.5 микрометров и максимальное смещение было более распределено на малых значениях. Как попродемонстрировано в этом ансамбле время среднего среднего квадратного смещения анализа, CTAB покрытием золотых нанородов обычно диффузных с альфа примерно один. Распределение плотности коэффициента диффузии и альфа, полученного со всех траекторий, однако, показывает, что динамика золотых нанородов демонстрирует неоднородное распределение со сверхдиффузией, броунительными и субдифференцированными движениями.
Кроме того, для характеристики двух репрезентативных долгосрочных ограниченных и движущихся траекторий можно использовать статистический анализ отдельных частиц и анализ параметров часовых рядов. Необходимо обобщить и извлечь одну новую интерпретацию данных из считывания анализа одного отслеживания частиц, поскольку, как правило, существуют некоторые трудные компромиссы.
