يستخدم بروتوكولنا تحليل تدقيق الجسيمات الواحدة لمراقبة الديناميكيات في الموقع والاتجاه، كما أنه يميز انتشار نانورود ذهبية على أغشية الخلايا. باستخدام هذه الطريقة، يمكن الحصول على كل من ديناميات الترجمة والدوران من نانورودس الذهبي ويمكن تحليلها بشكل شامل ودينامية. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة أنواع أخرى من النظم البيولوجية المعقدة.
تبدأ عن طريق حرق الايثانول انخفض الزجاج الأغطية على اللهب ووضع غطاء في 35 في 10 ملليمتر طبق ثقافة الخلية التي تحتوي على ملليلتر اثنين من خلية ثقافة المتوسطة دون الفينول الأحمر. إضافة 50 microliters من تعليق الخلية من الفائدة على غطاء يهز بلطف الطبق ذهابا وإيابا واليسار واليمين لتوزيع الخلايا بالتساوي. ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 12 ساعة تقريبًا حتى تصل الخلايا إلى 20 إلى 40٪ قبل إضافة 20 ميكرولترات من نانورود الذهب المغلفة بـ CTAB إلى الطبق.
بعد اهتزاز لطيف لتفريق نانورودس بالتساوي عبر الطبق، وضع الطبق في جو مرطب لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة، ببطء نقل 100 ميكرولترات من السوبر من الطبق في الأخدود من شريحة زجاجية ووضع بعناية الجانب خلية coverlip أسفل على الأخدود الشريحة، ثم ختم حافة الغطاء مع طلاء الأظافر والسماح لطلاء الأظافر الجافة قبل وضع الشريحة على مرحلة المجهر darkfieldfield. لتتبع الجسيمات واحدة عن طريق المجهر darkfieldfield، ضع قطرة من الزيت على النفط يغمر مكثف الحقول المظلمة وتحويل مقبض الباب حتى المكثف اتصالات الشريحة الزجاجية.
ضع قطرة من الزيت على الجزء العلوي من الزجاج الغطاء، وبدوره مقبض التركيز حتى 60X النفط الغمر الهدف يمس النفط. بدوره على مصدر الضوء وتحويل قليلا مقبض التركيز على التركيز على الطائرة التصوير. ثم انقر فوق رمز الكاميرا في برنامج المجهر لتسجيل عينة تشتت ضوء سلسلة الوقت باستخدام كاميرا CMOS اللون وحفظ الصورة في تنسيق TIFF.
لاستخراج مسار واحد طويل المدى، افتح الصورة في ImageJ وانقر على الصورة، واكتب، و8 بت لتحويل الصورة من وضع RGB إلى وضع 8 بت. لضبط التباين، انقر فوق الصورة، وضبط، وتباين السطوع، وتعيين المعلمات. حدد الجسيمات الهدف واستخدام التحكم العاشر لقطع الخلفية سلسلة الوقت.
انقر فوق الإضافات ، وتعقب الجسيمات الكلاسيكية ، وتعقب الجسيمات لفتح كشف الجسيمات والجسيمات التي تربط النافذة وتعيين دائرة نصف قطرها إلى ستة ، وقطع إلى الصفر ، والمئين إلى 0.01 ٪ تعيين نطاق الارتباط إلى 10 والتشريد إلى 10 وانقر فوق موافق لفتح نافذة نتائج تعقب الجسيمات لرؤية النتائج. انقر على تصور جميع المسارات لفحص المسارات التي تم إنشاؤها. إذا كان البرنامج ولدت مسار والمسار المتحرك من نانورود الذهب مطابقة، انقر فوق حفظ التقرير الكامل لحفظ النتائج.
إذا كان المسار البرمجي الذي تم إنشاؤه لا يطابق المسار المتحرك لل nanorods الذهبية، فانقر فوق جزيئات إعادة الربط لإعادة ربط الجسيمات المكتشفة بنطاق وصلة مختلفة ومعلمات المئين. للعثور على تنسيق بكسل الوسط من نانورود الذهب في كل إطار وفقا لإحداثيات س ص، استخدم xycoordination. m الدالة.
لتحديد مصفوفة ثلاثة في ثلاثة بكسل، استخراج تسعة قيم كثافة التشتت للقنوات الحمراء أو الخضراء وحساب قيمة متوسط، استخدم rgextraction. m الدالة. ثم استخدام polarangle.
م الدالة لحساب الزوايا القطبية باستخدام طريقة تفاضلية قناة مزدوجة. لحساب معلمات حيوية باستخدام الصيغ في الجدول، قم بتشغيل البرامج النصية للتحليل اثنين. للتحليل المرئي للمسار، قم بتعيين تنسيق س كـ X، وإحداثيات ص كـ Y، والوقت كـ Y، ثم انقر فوق مخطط الرسم، التشتت، و خريطة اللون، قم بتعيين معلمات الرسم البياني، ثم أضف شريط الألوان.
لإنشاء متوسط إزاحة مربعة الفاصل الزمني الأشكال الفاصلة، تعيين الفاصل الزمني كـ س و إزاحة مربع المتوسط كـ Y.Click رسم، مبعثر، تحليل، تركيب، منحنى غير خطي المناسب والحوار المفتوح وتعيين معلمات الرسم البياني. للتحليل الإحصائي متعدد الجسيمات، قم بتعيين المعلمات الديناميكية ذات الاهتمام كـ Y وانقر فوق الرسم والمرسم البياني. انقر نقراً مزدوجاً فوق الرسم البياني لتعيين حجم القسمة أو عدد الأقسام وانقر فوق تطبيق.
ثم أضف عموداً وقم بتعيين معلمات الرسم البياني. لتحليل سلسلة زمنية، تعيين الوقت كـ X ومعلمات سلسلة الوقت كـ Y.Click رسم، متعددة الأجزاء، وكومة. في النافذة المنبثقة، حدد سطرًا و موافق. ثم قم بتعيين المعلمات للرسم البياني.
الحد الأقصى البلازمي الطولي من 40 من قبل 85 نانومتر CTAB مطلية الذهب نانورودس هو ما يقرب من 650 نانومتر والرنين عرضية هو 520 نانومتر. كثافة التشتت من نانورود الذهب المغلفة CTAB على أغشية الخلايا U87 يوضح توزيع غاوسي نموذجية مع عرض ضيق يتفق مع ذلك من نانورود الذهب المغلفة CTAB على الزجاج مما يدل على أن نانورود الذهب المغلفة CTAB تتبع في هذه التجربة monodispersed بشكل جيد. وكما هو موضح، يمكن تتبع أكثر من 500 مسار من مسارات النانو ونرود الذهب المغلفة بعلامة التبويب CTAB عن طريق المجهر المظلم ويمكن تقسيمها إلى مسارات انتشار طويلة المدى ومسارات انتشار محدودة.
وقد أظهر نصف قطر الـ 500 مسار في هذا التحليل التمثيلي توزيعاً صغيراً للقيمة مع نصف قطر متوسط للمقاييس الـ 0.5 وكان الحد الأقصى للنزوح أكثر توزيعاً على القيم الصغيرة. كما هو موضح في هذا المتوسط الزمني الفرقة متوسط تحليل إزاحة مربع، وCTAB المغلفة نانورود الذهب تنتشر عادة مع ألفا من واحد تقريبا. توزيع كثافة معامل الانتشار ألفا التي تم الحصول عليها من جميع المسارات، ومع ذلك، يكشف أن دينامية نانورود الذهب معارض توزيع غير متجانسة مع superdiffusion، براونيان، والحركات تحت درجة.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام التحليل الإحصائي للجسيمات الواحدة وتحليل بارامترات السلسلة الزمنية لتوصيف مسارين تمثيليين محصورين ومتحركين على المدى الطويل. من الضروري تلخيص واستخراج تفسير جديد واحد للبيانات من قراءة تحليل تتبع الجسيمات الواحدة حيث توجد عادة بعض المقايضات الصعبة التي يجب القيام بها.
