Характеристика структуры белка имеет важное значение для понимания его функции. Масс-спектрометрия стала мощным инструментом для этой цели, особенно для белковых систем, которые трудно изучать традиционными методами. Для изучения структуры белка по массовой спецификации в растворе проводят специфические химические реакции, которые кодируют структурную информацию белка в его массу.
Одним из особенно эффективных подходов является использование реагентов, которые ковалентно модифицируют решение доступных боковых цепей аминокислот. Эти реакции приводят к увеличению массы, которое может быть локализовано с разрешением уровня остатка в сочетании с протеолитическим сбраживанием и тандемной масс-спектрометрией. Здесь мы описали протоколы, связанные с использованием диэтилпирокарбоната или DEPC в качестве ковалентного маркировочного реагента вместе с обнаружением массовых спецификаций.
DEPC представляет собой высокоэлектрофильной молекулой, способной маркировать до 30% остатков в среднем белке, тем самым обеспечивая отличное структурное разрешение. DEPC успешно используется вместе с масс-спецификацией для получения структурной информации для многих различных белков. Начните с приготовления буферного раствора интересующего вас белка в концентрации в диапазоне десятков микромоляров.
Мы обычно используем 10-миллимолярный буфер pH 7,4 MOPS. Альтернативно, существующий белковый раствор может быть буферным обменом в MOPS или другой буфер, если исходный образец содержит буфер, который имеет нуклеофильные функциональные группы. Необходимо, чтобы буфер не имели нуклеофильных функциональных групп, потому что они будут мешать белковой реакции DEPC.
В другой микротрубке готовят стоковый раствор 100 миллимоляров DEPC в сухом ацетонитриле. Приготовление бульонного раствора в сухом ацетонитриле необходимо для предотвращения гидролиза DEPC. В новой микропробирке приготовьте раствор одного молярового имидазола в воде класса ВЭЖХ.
В новой микротрубке смешайте буфер MOPS и раствор белков. К белку и буферу добавьте аликвоту раствора DEPC, убедившись, что он правильно перемешивается, прежде чем поместить реакционную смесь на водяную баню с 37 градусами Цельсия в течение одной минуты. Объем используемого раствора DEPC следует выбирать на основе конечного коэффициента концентрации белка DEPC, который является желаемым.
Не существует единого набора DEPC и белковых концентраций, которые будут работать с каждым белком, хотя оптимальная концентрация DEPC может быть оценена на основе количества доступных растворителю остатков гистидина и лизина, присутствующих в белке. Следует отметить, что объем добавленного ацетонитрила, который фактически является объемом добавленного раствора DEPC, не должен превышать 1% от общего объема реакции, чтобы избежать возмущения белковой структуры во время реакции. Время реакции в конечном счете остается за пользователем, хотя одноминутная реакция при условии примера сводит к минимуму маркировку белка и гидролиз DEPC.
По прошествии одной минуты погасите реакцию, добавив имидазол, чтобы очистить оставшуюся часть на реагирующий DEPC. Убедитесь, что конечная концентрация имидазола в 50 раз превышает концентрацию DEPC. Чтобы идентифицировать остатки, которые были модифицированы DEPC, белок должен быть протеолитически переварен в пептидные фрагменты.
Для пищеварения выбирайте условия, которые поддаются интересуя белку. Общие шаги, которые описаны здесь, включают развертывание белка, а затем уменьшение и алкилирование дисульфидных связей, чтобы можно было улучшить эффективность пищеварения. По нашему опыту, раскрытие белка с денатурантом и теплом перед пищеварением улучшает эффективность пищеварения.
Пока белок разворачивается, сравните растворы TCEP и йодоацетамида в соответствующем буфере пищеварения. TCEP следует использовать в качестве восстановителя вместо дитиотрейтола или DTT, поскольку DTT может реагировать с модифицированными остатками DEPC. Алкилирование полученных файлов после восстановления необходимо для предотвращения скремблирования меток, при котором свободные файлы и белок вступают в реакцию с модифицированными аминокислотами.
После завершения этапа разворачивания уменьшите дисульфидные связи, добавив TCEP в реакционную смесь и дайте ей вступить в реакцию в течение трех минут при комнатной температуре. После восстановления добавьте в реакционную смесь йодоацетамид, дайте ей вступить в реакцию в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Достигается здесь путем помещения реакционной смеси в коробку.
Конечная концентрация йодоацетамида должна быть в два раза выше концентрации, используемой для TCEP, или в 80 раз выше концентрации белка или дисульфидной связи. Готовят интересующих фермент, обычно трипсин или химотрипсин согласно спецификациям производителя. После приготовления фермента выбора начинают пищеварение и инкубируют реакционную смесь при 37 градусах Цельсия.
Соотношение белка и фермента 10: 1 с трехчасовым пищеварением с использованием иммобилизованных ферментов, как правило, является хорошим выбором для белков, меченых DEPC. После сбраживания образец должен быть либо немедленно проанализирован LC-MS/MS, либо заморожен жидким азотом, чтобы свести к минимуму деградацию образца и потерю этикетки. Стандартные параметры LC-MS/MS для протеомики снизу вверх могут быть использованы для идентификации меченых участков на фрагментах протеолитических пептидов.
Для достижения наилучшего разделения пептидов следует использовать стационарную фазу обратной фазы C18. По нашему опыту, капиллярный LC предоставляет более надежную количественную информацию об уровнях модификации, чем нано LC из-за более высоких количеств используемого образца. Типичная подвижная фаза LC, которая используется для разделения меченых DEPC пептидов, состоит из двух растворителей.
Растворитель А представляет собой воду с 0,1% муравьиной кислоты, а растворитель В представляет собой ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислоты. Используется градиентное элюдение, и время разделения может быть оптимизировано в зависимости от сложности образца. Масс-спектрометр, способный выполнять онлайн-LC-MS и MS/MS, необходим для идентификации участков модификации DEPC на пептидах.
В наших экспериментах мы успешно использовали несколько типов масс-спектрометров. Мы обнаружили, что Thermo Orbitrap Fusion дает отличные результаты, хотя любой масс-спектрометр, способный автоматически выполнять MS / MS многих пептидов в ходе анализа LC-MS, должен быть подходящим. Условия ВЭЖХ и масс-спектрометрические параметры должны быть правильно установлены до начала измерения.
Если образец был заморожен во вспышке, его следует разморозить непосредственно перед анализом. Постарайтесь сделать все возможное, чтобы свести к минимуму время между пробоподготовкой и инъекцией ВЭЖХ. Загрузите и введйте переваренный меченый образец белка в систему LC и начните сбор LC-MS / MS или идентификацию сайта маркировки DEPC и количественную оценку пиковой области, существует несколько методов.
На инструментах Thermo Fisher может использоваться экскалибур или протеомный первооткрыватель. Задайте соответствующие параметры для идентификации пептидов в программе. Добавление DEPC и карбамидометилирование включены в качестве переменных модификаций, помогающих остаткам или выделенным.
Хроматографические пиковые области модифицированных и немодифицированных версий пептидов используются для определения процентов изменения уровня остатка. Маркировка DEPC с обнаружением РС также является ценным инструментом для характеристики структурных изменений более высокого порядка в белках. Из нашего исследования ковалентная маркировка DEPC может идентифицировать конкретные белковые области, которые претерпевают структурные изменения при термическом и окислительном стрессе.
На рисунке значительные изменения в процентах модификации показаны синим цветом для уменьшения маркировки и красным цветом для увеличения маркировки, в то время как остатки без значительных изменений маркировки показаны бледно-зеленым цветом. Например, после того, как бета-2 микроглобулин подвергается тепловому стрессу, многие остатки, которые подвергаются значительному снижению степени маркировки, N-концевой, серин 28, гистидин 31, серин 33, серин 55, серин 57 и лизин 58 находятся ближе, чем одна сторона белка, предполагая, что эта область белка претерпевает подтверждающее изменение или, возможно, опосредует агрегацию. После того, как белок подвергается окислительному стрессу, различные остатки со снижением маркировки, серин 11, гистидин 13, лизин 19, лизин 41 и лизин 94 из кластера на другой фазе белка, указывающие на то, что вызванное окислением подтверждающее изменение происходит в другом месте.
Это исследование имеет важные последствия для белковой терапии, которая в настоящее время является самым быстрорастущим сегментом фармацевтического рынка. Другая работа нашей группы также показала, что массовая спецификация ковалентной маркировки DEPC может обнаруживать и идентифицировать места подтверждающих изменений в терапии стрессовыми моноклональными антителами. Как видите, ковалентная маркировка с помощью DEPC проста в экспериментальной реализации, но может предоставить ценную структурную информацию для белков.
Структурное разрешение, обеспечиваемое масс-спецификацией маркировки DEPC, является скромным по сравнению с такими методами, как рентгеновская кристаллография и ЯМР, но оно поддалось практически любому белку, независимо от его размера или способности кристаллизоваться. Спецификация массы ковалентной маркировки DEPC также работает с белковыми смесями и может работать с очень сложными типами образцов, такими как клеточный лизат и клетки haCat. Посмотрев это видео, мы уверены, что вы найдете маркировку DEPC полезным инструментом для характеристики структуры белка.
