Наш протокол позволяет эффективно идентифицировать гены или комбинации генов, которые блокируют инвазию рака у зрителя. над культурой не требуется развитое животноводическое оборудование для содержания. В целом, как общие, так и общие специальные библиотеки могут быть экранированы в течение нескольких недель в просмотрщике.
Эта система скрининга поможет исследователям обнаружить новые терапевтические генные мишени или комбинации генных мишеней, которые могут быть использованы для блокирования метастазирования рака. Для внутривенной инъекции концентрируйте клетки до 0,5-1 миллиона клеток на миллилитр, используя ледяной холод 1X PBS для разбавления или повторной приостановки клеток. Ожидайте, что примерно один миллилитр клеточной суспензии будет необходим на каждые 10 эмбрионов.
Чтобы собрать инъекционный аппарат, установите иглу на шприц, а затем протяните иглу шприца с помощью куска трубки длиной от трех до пяти сантиметров. Разбейте кончик боросиликатной иглы с помощью тонких щипцов. Загрузите шприц от 50 до 200 микролитров суспензии раковых клеток.
И вставьте боросиликатную иглу в трубку. Осмотрите иглу на предмет закупорки клеток и пузырьков воздуха. Если в капилляре наблюдается закупорка клеток, удалите капилляр, повторно приостановите клетки и замените его новым капилляром.
Используйте плунжер, чтобы вытолкнуть любые пузырьки. Снимите крышку крышки и перенесите эмбрион под стереоскоп. Определите подходящую вену для введения на поверхность CAM; которая обычно лишь немного шире диаметра кончика боросиликатной иглы и расположена на полпути между эмбрионом и стенкой весовой чашки.
Как правило, легче вводить в точку, непосредственно прилегающую к бифуркации вен. Прижмите кончик иглы к стенке кровеносного сосуда и нажмите мягкое давление в том же направлении, что и кровоток. При необходимости используйте ватный тампон, чтобы помочь закрепить или стабилизировать сосуд, который вводится.
Осторожно нажмите на поршень шприца в течение 2-10 секунд, пока не будет введен желаемый объем. Выбросьте эмбрион, если в месте инъекции появится чрезмерное кровотечение или прозрачное скопление жидкости. Извлеките иглу из КАМ и аккуратно смажайте место инъекции валопчатобумажным тампоном, чтобы удалить кровь или лишние раковые клетки.
Накройте введенный эмбрион в весовую чашку крышкой и верните его в инкубатор. Повторяйте процедуру до тех пор, пока не будут введены все эмбрионы. Визуально осмотрите эмбрионы на наличие бактерий или загрязнения плесенью или смерти.
И выбрасывать зараженные эмбрионы в соответствии с лабораторными процедурами утилизации. Убедитесь, что метастатические колонии кажутся однородными по форме в течение первых одного-трех дней после инъекции. И выявлять инвазивные или неинвазивные метастатические колонии на четвертом-пятом днях после инъекции.
На пятый день после инъекции извлеките эмбрионы из инкубатора и осмотрите и найдите CAMs эмбриона для метастатического распределения колоний. Под рассеченным микроскопом осторожно потяните ткань CAM, содержащую метастатическую колонию интереса, вверх с помощью тонких щипцов и отрежьте ее хирургическими ножницами. Переложите ткань CAM в пустую, стерильную трубку размером 1,5 миллилитра и закройте крышку трубки.
Повторяйте процедуру иссечения до тех пор, пока все интересующих колонии не будут собраны в отдельные трубки. Осторожно измеряйте ткань CAM в микроцентрифужной трубке, используя отдельную стерильную иглу 18 калибра для каждой колонии. Добавьте 100 микролитров 1X раствора коллагена-А и высиживая в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
Раскрутите клетки и ткань CAM в 300 раз G в течение пяти минут при температуре окружающей среды. Аспирировать раствор коллагена-А и повторно приостановить клетки неполной среды для интересуемой клеточной линии. Затем снова раскрутите клетки и ткани.
Повторно суспендирует клетки и кусочки тканей в одном миллилитрах полной среды и фактора отбора, если таковой имеется. Затем переложить в одну 12-ю скважинную посуду для посева тканей. В течение следующих одной-трех недель ежедневно контролируйте раковые клетки на предмет роста и загрязнения.
Когда клетки достигнут 70-80% конфюсности, переложите их в чашку для культивовки большего объема. Приступайте к секвенированию или следующему раунду отбора, как только будет достигнуто адекватное количество раковых клеток. Эмбрионы, демонстрирующие накопление раковых клеток из-за неудачной инъекции, можно увидеть в большинстве капилляров.
Когда достигается оптимальная концентрация клеток и продолжительность инъекции, трансдуцированные клетки после инъекции должны производить широкий спектр колониальных фенотипов, причем большинство колоний инвазивны, как определяется раковыми клетками, появляющимися разбросанными в ткани CAM. Следует обратить внимание на метастатические колонии, которые кажутся компактными и расположены достаточно далеко от соседних колоний, чтобы их можно было иссечены щипцами и ножницами и одним куском ткани CAM. Изолированное положительное попадание на экран должно отображать компактный фенотип колонии при повторной инъекции.
Для измерения контактов кровеносных сосудов раковых клеток следует обратить внимание на яркость пятна сосудистой стенки и ввести соответствующее количество лектинов для сигнала сосудистой стенки. При попытке этого протокола избегайте под или над инъекцией и удалите чрезмерное кровотечение или накопление жидкости. Несколько новых генов, которые управляют инвазией раковых клеток в зритель, были идентифицированы с использованием этой техники.
