Данный протокол позволяет инвиво изучать ранние взаимодействия между опухолевыми клетками и нервами и изучать молекулярные пути вторжения нервов в рак. Основными преимуществами этого метода являются короткое экспериментальное время с потенциалом для изучения промежного вторжения и других фенотипов рака в том же эксперименте. Прежде чем попробовать этот метод в первый раз, мы рекомендуем практиковать бурение коммерческих неудобренных яйцеклеток и уборки спинного корня ганглиев для оптимизации вашей техники для обеих процедур.
Демонстрацией процедуры будет Мин Лю, научный сотрудник из моей лаборатории. Начните с инкубации шести коммерческих безпатогенных оплодотворенных яйцеклеток на экспериментальную группу в инкубаторе увлажнения яйцеклеток при 38 градусах Цельсия и 54% влажности в первый день после оплодотворения в течение восьми дней с почасовым вращением. На восьмой день очистите спинную кожу усыпанной крысы 70%этанолом и используйте ножницы для удаления позвоночника.
Разделите шейный, грудной и поясничный области и поместите секции позвоночника в 10-сантиметровое блюдо культуры с PBS, чтобы сохранить образцы тканей гидратированных. Используя тонкие костяные ножницы, откройте грудные и шейные кости позвонков в спинных и желудочных аспектах, чтобы разделить позвоночник на две боковой половинки и поместить секции тканей в чистую 10-сантиметровую тарелку со свежим PBS. Используя типсы, аккуратно отсоедините спинной мозг от костей позвонков, чтобы визуализировать спинные корневые ганглии.
Размещая кончики пары тонких типсов, удерживаемых под каждым ганглияю, возьмите ткань и вытащите ее из костной полости, в которой она находится. Сразу же после сбора урожая, поместите каждый ганглион в DMEM культуры среды дополняется 2%пенициллин и стрептомицин или Пен-Стреп и 10%фетальной сыворотки крупного рогатого скота или FBS, чтобы помочь предотвратить бактериальное загрязнение нервных тканей. Когда все ганглии были собраны, передать ткани в новую культуру блюдо, содержащее свежие DMEM культуры среды дополнены 2%Pen-Strep плюс 10%FBS и 1,2 микрограмма на миллилитр красного флуоресцентного красителя для одного часа инкубации в инкубаторе клеточной культуры.
Чтобы подготовить яйца для спинного корня ganglion трансплантата, тусклый свет в шкафу ламинарного потока и проведение яйцо с естественным воздушным мешком к источнику света, транслюминировать каждое яйцо, чтобы проверить на жизнеспособность цыпленка и эмбриональной фазы. Определите привязанность развивающегося эмбриона к хориоаллантической мембране как темный движущийся сосуд, прикрепленный к яичной мембране, и используйте карандаш, чтобы отметить привязанность, чтобы избежать вмешательства в этом регионе. Нарисуйте 1,5-сантиметровую область в хорошо васкуляризированной области по крайней мере в двух сантиметрах от крепления эмбриона, чтобы выступать в качестве операционной оконной зоны и нарисовать квадрат 0,5 сантиметра в менее васкуляризированной области примерно в одном сантиметре от операционного окна.
Затем отметим центр области воздушного мешка. Затем используйте роторный инструмент и гравировочку диаметром три миллиметра, чтобы тщательно просверлить яичную скорлупу в пределах отмеченного квадрата. Используйте тупые типсы, чтобы удалить яичную скорлупу, не удаляя белую внешнюю мембрану яичной скорлупы прямо под оболочкой.
Используйте дрель, чтобы тщательно сделать точное упражнение перфорации в отмеченном кресте в области воздушного мешка, чтобы поток воздуха в яйцо, не нарушая или повреждения оболочки и добавить 30 микролитров HBSS к квадратному открытию над нетронутой внешней мембраны яичной скорлупы. Используя 30 калибровочных игл, сделайте точечную перфорацию во внешней мембране в квадратной области. Затем удерживайте яйцо до источника света, чтобы визуализировать воздушный мешок и оказать давление на глазную резиновую лампу.
Поместите лампочку eyedropper над небольшой перфорацией в воздушном мешке и отпустите давление на лампу до тех пор, пока не будет достигнуто разделение внешней мембраны и хориоалантоических мембран в зоне операционного окна, повторяя этот шаг до полного разделения мембран. Когда все яйца были изменены таким же образом, сверлить круговое операционное окно в одном яйце, заботясь, чтобы не разорвать внешнюю мембрану яичной скорлупы и использовать липкую сторону кусок клейкой лентой, чтобы удалить любые свободные частицы из оболочки. Используя тупые типсы, удалите яичную скорлупу из пробуреной области, а затем внешней мембраны яичной скорлупы позаботился, чтобы не ввести мелкие частицы оболочки внутри яйца, чтобы свести к минимуму загрязнение.
Когда яичная скорлупа и внешняя мембрана были удалены, как показано на фото, накройте яйца парафиновой восковой мембраной и поместите яйца обратно в яичный инкубатор без вращения до тех пор, пока спинной корень ганглиев не будет готов к прививке. Для прививки спинного корня ганглия на хориоаллантической мембраны, использовать тонкие стерильные типсы, чтобы тщательно понять один ганглия в культуре блюдо и аккуратно мыть ткани в контейнере свежего HBSS. Поместите ганглия на чориоаллантическую мембрану одного яйца, будучи осторожным, чтобы не проколоть мембрану и покрыть все отверстия яйца стерильными прозрачными повязками пленки.
Когда все яйца были привиты, вернуть их в увлажняющий инкубатор яйцо в течение двух дней без вращения. В конце инкубации перенесите яйца в шкаф для ламинарного потока и используйте ножницы и типсы, чтобы открыть прозрачную пленку. Далее добавьте от 0,5 до одного миллиона флуоресцентно помеченных опухолевых клеток в пяти микролитров HBSS на хориоаллантической мембране каждого яйца около двух миллиметров от каждого спинного корня ганглия поддержанию равномерного расстояния между ганглиями и клетками.
Затем накройте яйца новой пленкой и верните яйца в яичный инкубатор на семь дней без вращения. В конце инкубации поместите яйца на верхнюю часть лабораторной скамейки. Используйте шприц для перфорации пленки заправки каждого яйца и применить около 300 микролитров 4%paraformaldehyde над каждой хориоаллантической мембраны, чтобы слегка ужесточить ткани для облегчения процесса сбора урожая.
Используя ножницы, удалить верхнюю половину яичной скорлупы с chorioallantoic мембраны прилагается. Уменьшите размер оболочки примерно до трех сантиметров в диаметре, сохраняя часть хориоаллантической мембраны, где спинной корневой ганглий и опухолевые клетки были привиты в центре фрагмента оболочки. Затем схватить chorioallantoic мембраны с тонкой типсов и отделить ткань от яичной скорлупы для передачи в один колодец из шести хорошо пластины, содержащей два миллилитров 4%paraformaldehyde на хорошо спинной корень ганглиона и опухолевых клеток сторону вверх.
Интеграция спинного корня ганглиев в хориоаллантической мембраны имеет важное значение, как хориоаллантической мембраны обеспечивает питание спинного корня ганглиона ткани во время эксперимента. Микроскопически, спинной корень ганглия наблюдается в соединительной ткани хориоаллантической мембраны и кровеносные сосуды часто видели внутри спинного корня ганглия ткани, предполагая, что chorioallantoic мембраны кровоснабжение воспитывает привитой ткани. Имплантированные опухоли также идентифицируются на хориоаллантической мембране гематоксилином и эозином окрашивания.
В зависимости от того, сколько вторжения присутствует, опухоли могут присутствовать без многочисленных островов опухоли вторжения соединительной ткани. В этом репрезентативном эксперименте, изображения с слиянием флуоресценции анализ показал увеличение вторжения спинного корня ганглиона в хориоаллантических мембран привитых опухолевых клеток над выражением рецептора галанина 2 по сравнению с контрольными опухолями. Эта полезная и экономически эффективная модель промежного вторжения может быть воспроизведена даже лабораториями с ограниченными ресурсами.
