Этот протокол важен, потому что он использует материал пациента. Если у пациента есть заболевание, использование его клеток должно более точно отражать биологическую реакцию пациента. Эта техника проста в выполнении, понятна и не требует сложного оборудования.
Эти методы могут быть использованы для диагностики, например, для доказательства того, что мутация RYR1 функционально изменяет гомеостаз кальция, а также для проверки потенциальной терапевтической функции соединения. В зависимости от знаний и технических навыков отдельного исследователя, тестовые эксперименты должны быть выполнены до того, как будут использованы фактические образцы пациентов. Для мониторинга изменений внутриклеточной концентрации кальция в В-трансформированных В-лимфоцитах повторно суспендируют увековеченные В-клетки в однократном размере от 10 до седьмых клеток на миллилитр концентрации в растворе Кребса Рингера и Фура-2 АМ до конечной концентрации пяти микромоляров для 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации соберите клетки путем центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в свежем растворе Кребса Рингера в два раза по 10-шестую клетку на миллилитр концентрации. Непосредственно перед началом эксперимента центрифугируйте клетки снова и быстро повторно суспендируйте клетки в 1,5 миллилитра раствора Кребса Рингера, дополненного 0,5-миллимолярным EGTA, но без добавления кальция. Перенесите ячейки в стеклянную трехмиллилитровую спектрофлуорометрическую кювету и запишите коэффициент флуоресценции на спектрофлуорометре, оснащенном магнитной мешалкой, установленной на максимальной скорости и 37 градусах Цельсия в течение примерно 30 секунд.
Чтобы оценить реакцию высвобождения кальция в отдельных клетках, нанесите один раз 106 загруженных клеток Fura-2 AM в одном миллилитре раствора Кребса Рингера, дополненного одномимолярным хлоридом кальция, на отдельные стеклянные крышки с поли-L-лизином покрытием и инкубируйте крышку при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе клеточной культуры в течение 30 минут. Когда клетки прикрепятся, поместите крышку в перфузионную камеру и начните перфузию клеток на двух миллилитрах раствора Кребса Рингера, дополненного одним миллимоляром кальция в минуту. Используя перевернутый флуоресцентный микроскоп, оснащенный 40-кратным масляным погружным объективом и соответствующими фильтрами, записывайте онлайн-измерения с помощью программно управляемой камеры с зарядовой связью с интервалом в одну секунду при фиксированном времени экспозиции.
Для достижения стимуляции клеток используйте стимулятор перфузии клеток с 12 клапанами для добавления различных концентраций агониста. Чтобы изолировать миотрубы из биопсии мышц человека, сначала промыть биопсию стерильным PBS, чтобы удалить избыток крови, прежде чем измельчать ткань на небольшие, от 0,5 до одного миллиметра фрагменты. Поместите два-три фрагмента в отдельные вкладыши в каждую лунку шестилуночной тканевой культуральной пластины, содержащей 1,5 миллилитра среды роста мышц человека на лунку и 500 микролитров среды на вставку, и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры.
Для измерения изменений экспрессии кальция в миотрубах человека, когда можно наблюдать многоядерные миотрубки, замените супернатанты культуры миотуб свежей дифференцирующей средой, дополненной 10 микролитрами одномимолярного Fura-2 AM для 30-минутной инкубации в инкубаторе клеточной культуры. В конце инкубации переложите одну стеклянную покровную скользящую культуру в перфузионную камеру и промойте клетки раствором Кребса Рингера, дополненным двухмиллимолярным хлоридом кальция. Затем выполните онлайн-измерения кальция, как показано с использованием 20-кратного объектива погружения в воду.
В этом репрезентативном анализе наблюдалось быстрое увеличение кальция в УВ-увековеченных В-лимфоцитах после добавления агониста, который медленно снижался до уровней покоя с течением времени. В аналогичном эксперименте добавление 400-наномолярного тапсигаргина вызывало большой переходный процесс кальция, который достигал пикового значения флуоресценции в 2,4 произвольных единицы. Это значение флуоресценции считалось равным 100%, когда была построена соответствующая кривая дозового ответа.
В этом анализе увековеченные В-клетки стимулировали пятимиллимолилярным кофеином в течение 20 секунд, что приводило к немедленному увеличению коэффициента флуоресценции 340 и 380 нанометров. Для каждой тестируемой концентрации кофеина был рассчитан и использован для построения кривой дозовой реакции пик, вызванный кофеином, в соотношении 340 на 380 нанометров флуоресценции. Высвобождение кальция из дифференцированных миотруб также может быть оценено в ответ на промывку хлоридом калия, различными концентрациями агониста и / или кофеина, и могут быть сгенерированы кривые нормальной реакции дозы.
Важно убедиться, что ячейки правильно загружены Fura-2 и что обе 340 и 380-нанометровые длины волн реагируют на добавление агониста. Внутриклеточные измерения кальция с флуоресцентными показателями кальция могут быть исследованы в большинстве клеток млекопитающих и могут быть применены для изучения внутриклеточных изменений кальция в ответ на различные раздражители.
