内源性表达人RYR1变异体的功能表征

该协议具有重要意义，因为它使用患者材料。如果患者患有这种疾病，使用他们的细胞应该更准确地反映患者的生物反应。这种技术易于执行，简单明了，并且不需要复杂的设备。

这些方法可用于诊断，例如，证明RYR1突变在功能上改变了钙稳态，以及测试化合物的潜在治疗功能。根据个别研究人员的知识和技术技能，应在使用实际患者样本之前进行测试实验。为了监测EBV转化的B淋巴细胞的细胞内钙浓度的变化，将永生化的B细胞以Krebs Ringer溶液中每毫升浓度的10至7个细胞重悬，Fura-2 AM重悬至最终浓度为5微摩尔，在37摄氏度下孵育30分钟。

在孵育结束时，通过离心收集细胞，并将沉淀以每毫升浓度的两倍10至6个细胞重悬于新鲜的克雷布斯林格溶液中。在开始实验之前，再次离心细胞，并迅速将细胞重悬于1.5毫升的克雷布斯林格溶液中，补充有0.5毫摩尔EGTA但没有添加钙。将细胞转移到玻璃三毫升荧光计比色皿中，并在配备磁力搅拌器的光谱荧光计上记录荧光比，最大速度和37摄氏度约30秒。

为了评估单个细胞中的钙释放反应，将106 Fura-2 AM加载的细胞在一毫升的Krebs Ringer溶液中加入一次，并补充有1毫摩尔氯化钙到单个聚-L-赖氨酸包覆的玻璃盖玻片上，并将盖玻片在37摄氏度下在加湿的细胞培养箱中孵育30分钟。当细胞附着时，将盖子滑入灌注室，然后开始以两毫升的克雷布斯林格溶液注注细胞，每分钟补充一毫摩尔钙。使用配备40倍油浸物镜和适当滤光片的倒置荧光显微镜，在固定曝光时间内，以一秒钟的间隔使用软件控制的电荷耦合设备相机附件记录在线测量结果。

为了达到细胞刺激，使用带有12个瓣膜的细胞灌注刺激器来添加不同浓度的激动剂。为了从人体肌肉活检中分离肌管，首先用无菌PBS冲洗活检以去除任何多余的血液，然后将组织切碎成0.5至1毫米的小碎片。将两到三个片段放入每孔组织培养板的每个孔中，每个孔中含有1.5毫升人肌肉生长培养基和每个插入物500微升培养基，并将板放入细胞培养箱中。

为了测量人肌管中钙表达的变化，当可以观察到多核肌管时，用补充有10微升1毫摩尔Fura-2 AM的新鲜分化培养基替换肌管培养物，在细胞培养箱中孵育30分钟。在孵育结束时，将一个玻璃盖玻片培养物转移到灌注室，并用补充有两毫摩尔氯化钙的克雷布斯林格溶液冲洗细胞。然后执行在线钙测量，如使用20次水浸物镜所示。

在这项具有代表性的分析中，在添加激动剂后，观察到EBV永生化的B淋巴细胞中钙的快速增加，随着时间的推移慢慢下降到静止水平。在类似的实验中，添加400-纳摩尔他西加净引起大钙瞬变，达到2.4任意单位的峰值荧光值。当构建相应的剂量反应曲线时，该荧光值被认为是100%。

在该分析中，永生化的B细胞被五毫摩尔咖啡因刺激20秒，导致340和380纳米荧光比立即增加。对于测试的每个咖啡因浓度，计算咖啡因诱导的峰值在340×380纳米荧光的比例下，并用于构建剂量反应曲线。也可以根据氯化钾冲洗、不同浓度的激动剂和/或咖啡因的响应来评估分化肌管的钙释放，并且可以生成正常剂量反应曲线。

重要的是要确保细胞正确加载Fura-2，并且340和380纳米波长都对激动剂的添加做出反应。使用荧光钙指示剂的细胞内钙测量可以在大多数哺乳动物细胞中进行研究，并且可以应用于研究响应于不同刺激的细胞内钙变化。