Этот протокол обеспечивает очистку Т-клеток INK, которые очень редки, и позволяет увеличить их количество в 30 раз. Очистка может быть выполнена за один день и получить большое количество готовых к использованию INK Т-клеток для исследований in vivo и in vitro за две недели. Продемонстрировать процедуру будет Глория Дельфанти, постдок в лаборатории.
После рассечения мышиной селезенки разбейте ее через 70-нанометровый клеточный сетчатый фильтр, чтобы получить одноклеточную суспензию в 10 миллилитрах PBS с 2% FBS. Центрифуга в 300 раз G в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу одним миллилитром стерильного буфера лизина калия хлорида аммония.
Инкубируют клетки в течение трех минут при комнатной температуре, затем блокируют пятью миллилитрами PBS с 2% FBS. Центрифуга в 300 раз G в течение пяти минут. После удаления супернатанта повторно суспендируют ячейку гранулы в трех миллилитрах PBS с 2% FBS и удаляют жировые остатки путем пипетирования.
Для этапов обогащения держите клетки холодными и используйте растворы, предварительно охлажденные при четырех градусах Цельсия, а затем хранящиеся на льду. Центрифуга в 300 раз G в течение пяти минут. Повторно суспендировать все клетки в соответствующем количестве PBS с блокатором 2% FPS и Fc и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
Промывайте одним-двумя миллилитрами буфера разделения MACS на 10 миллионов клеток и центрифугой в 300 раз G в течение 10 минут. После удаления супернатанта окрашивают клетки CD19-FITC и H2-IAb-FITC и инкубируют в течение 15 минут в темноте при четырех-восьми градусах Цельсия. Промывайте клетки, добавляя от одного до двух миллилитров буфера MACS на 10 миллионов клеток и центрифугу в 300 раз G в течение 10 минут.
Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 90 микролитрах буфера MACS на 10 миллионов клеток. Добавьте 10 микролитров анти-FITC микрошариков на 10 миллионов клеток. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут в темноте при четырех-восьми градусах Цельсия.
Промывайте клетки, добавляя от одного до двух миллилитров буфера MACS на 10 миллионов клеток и центрифугу в 300 раз G в течение 10 минут. Удалите супернатант и повторно суспендируйте до 125 миллионов клеток в 500 микролитрах буфера MACS. Поместите столбец LD в магнитное поле сепаратора MACS.
Чтобы избежать засорения, нанесите фильтр предварительного разделения на колонку LD и промойте его двумя миллилитрами буфера MACS. Нанесите суспензию ячеек на фильтр и соберите непомеченные ячейки, которые проходят через столбец. Промыть резервуар пустой колонны три раза одним миллилитром буфера MACS.
Соберите обогащенные Т-клетками стоки и подсчитайте ячейки, сохранив 50 микролитров для анализа FACS. После центрифугирования в 300 раз G в течение пяти минут удаляют супернатант и окрашивают клетки тетрамером-ПЭ CD1d. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 30 минут в темноте на льду.
Промывайте клетки, добавляя от одного до двух миллилитров буфера MACS на 10 миллионов клеток. После центрифугирования в 300 раз G в течение 10 минут удаляют супернатант и повторно суспендируют ячейку гранулы в 80 микролитрах буфера MACS на 10 миллионов клеток. Добавьте 20 микролитров анти-ПЭ микрошариков на 10 миллионов клеток.
Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут в темноте при четырех-восьми градусах Цельсия. Промывайте клетки, добавляя от одного до двух миллилитров буфера MACS на 10 миллионов клеток и центрифугу в 300 раз G в течение 10 минут. Удалите супернатант и повторно суспендируйте до 100 миллионов клеток в 500 микролитрах буфера MACS.
В соответствии с количеством ячеек поместите столбец LS или MS в магнитное поле сепаратора MACS и промойте столбец буфером MACS. Нанесите суспензию ячеек на столбец, соберите непомеченные ячейки, которые проходят через него, и промойте столбец три раза, как описано ранее. Это отрицательная доля.
Извлеките столбец из магнитного поля и поместите его на новую коллекционную трубку. Пипетка MACS буферизуется на колонну и проталкивает предоставленный плунжер в колонну, чтобы вымыть положительную фракцию, обогащенную Т-клетками INK. Для дальнейшего увеличения восстановления Т-клеток INK центрифугируют отрицательную фракцию в 300 раз G в течение 10 минут и повторяют предыдущие шаги с новым столбцом LS или MS.
Извлеките положительные фракции и определите количество ячеек. Держите 50 микролитров как положительных, так и отрицательных фракций для анализа FACS для проверки чистоты. Чтобы активировать Т-клетки INK в соотношении один к одному, перенесите соответствующий объем магнитных шариков против CD3 и CD28 в трубку и при равном объеме PBS, затем вихрь в течение пяти секунд.
Поместите трубку на магнит на одну минуту и выбросьте супернатант. Снимите трубку с магнита и повторно суспендируйте промытые магнитные шарики в нужном объеме RPMI. Центрифуга очищает INK Т-клетки в 300 раз G в течение пяти минут и смешивает их с мышиными Т-активаторами анти-CD3 или CD28 магнитными шариками.
Пластинчатый один миллилитр клеточной суспензии, анти-CD23 и CD28 магнитные шарики в 48-луночной пластине с 20 единицами на миллилитр IL-2, затем инкубируют при 37 градусах Цельсия. Через пять дней добавьте 10 нанограмм на миллилитр IL-7. Разделите клетки пополам, когда они достигнут 80-90% слияния, всегда добавляя 20 единиц на миллилитр IL-2 и 10 нанограммов на миллилитр IL-7.
В этих условиях Т-клетки INK могут быть расширены на срок до 15 дней. Используя этот протокол, Т-клетки INK обогащаются из селезенки трансгенных мышей посредством процесса иммуномагнитного разделения. После обогащения клетки могут быть расширены шариками против CD3 и CD28, что приводит к 30-кратному расширению в среднем к 14-му дню культуры.
Сильная активация бусинами против CD3 и против CD индуцировала снижение регуляции экспрессии TCR Т-клеток IMK на поверхности клетки, и появилась двойная отрицательная популяция. Большинство расширенных Т-клеток INK являются CD4-отрицательными. Характеристика линейно-специфических факторов транскрипции PLZF и ROR gamma T позволила идентифицировать фенотипы NKT1, NKT2 и NKT17 на обогащенных INK Т-клетках на нулевом и 14-м дне.
Обогащенные INK Т-клетки показывают Т80-подобный эффекторный фенотип, который сохраняется после 14 дней расширения, что подтверждается секрецией как интерферона гамма, так и IL-4 после стимуляции PMA и иономицина. Во время этапов очистки не забывайте быстро работать с предварительно охлажденными растворами и избавляться от любых жировых остатков, которые могут быть замечены во время пипетки. Расширенные Т-клетки INK могут быть использованы для анализов in vitro и переноса in vivo мышам, даже после функциональных модификаций посредством переноса или редактирования генов.
Расширение IN VITRO Т-клеток INK преодолевает ограничение, вызванное нехваткой, что делает их пригодными для использования в доклинических исследованиях в области иммунного надзора за опухолями, инфекционных заболеваний и аутоиммунитета.
