Наш протокол облегчает разработку полимерно-наночастиц гидрогелей для использования в качестве биоматериалов. Мы надеемся, что исследователи разработают этот материал для трансляционных приложений и изучения основных биологических вопросов. Гидрогели PNP легко вводятся через иглы малого диаметра и катетеры, но быстро самовосполняются после инъекции.
Это позволяет осуществлять неинвазивную контролируемую доставку лекарств и клеток в течение длительного времени. Эта технология раздвигает границы локализованной терапии и расширенного высвобождения лекарств, что имеет последствия для широкого спектра бушующих состояний от рака до регенерации тканей и пассивной иммунизации. Чтобы синтезировать наночастицы путем наноопципития, добавьте 50 миллиграммов полимера PEG-PLA в восьмимиллилитровой стеклянный сцинтилляционный флакон и добавьте один миллилитр ацетонитрила во флакон.
Вихрь полностью растворяется. Затем добавьте 10 миллилитров сверхчистой воды в 20-миллилитровую стеклянную сцинтилляционную пропискую с небольшим перемешиванием и поместите флакон на перемешиваемую пластину, установленную на 600 оборотов в минуту. Используйте пипетку объемом 200 микролитра, чтобы добавить один миллилитр раствора полимерного растворителя по каплям во флакон с водой.
Наночастицы ядра-оболочки будут образовываться, когда раствор полимерного растворителя быстро диспергируется по всей воде. Проверка размера частиц путем динамического рассеяния света в соответствии со стандартными протоколами. Затем переместите раствор наночастиц в центробежный фильтрующий блок, чтобы сконцентрировать раствор менее чем на 250 микролитров и повторно суспендировать наночастицы в соответствующем буфере.
Чтобы приготовить гидрогель, добавьте 333 миллиграмма 6%-го раствора HPMC-C12 к одномилитровому шприцу Luer Lock и добавьте 500 микролитров 20%-ного раствора наночастиц и 167 микролитров PBS к восьмимиллилитровому флакону. После смешивания используйте иглу, чтобы заполнить еще один миллилитр шприц Luer lock разбавленным раствором наночастиц и прикрепите два шприца к локтевому миксеру. Смешайте два раствора в течение примерно 60 циклов до образования однородного, непрозрачного белого гидрогеля.
Для измерения реологических свойств сформулированного гидрогеля вводят соответствующий объем гидрогеля в соответствии с выбранной геометрией зазора в центр зубчатой пластины реометра и используют колебательные и проточные испытания для измерения механических свойств образца. Чтобы охарактеризовать высвобождение препарата из гидрогеля, сначала подготовьте стеклянные капилляры, используя эпоксидную смолу для герметизации одного конца каждой трубки. Когда эпоксидная смола установится, используйте четырехдюймовую иглу для подкожных инъекций 22-го калибра, чтобы ввести от 100 до 200 микролитров гидрогеля в как минимум три пробирки на образец и осторожно добавьте от 200 до 300 микролитров PBS на каждый объем гидрогеля.
В соответствующие моменты времени, в соответствии с ожидаемой временной шкалой высвобождения препарата, используйте иглу, чтобы аккуратно удалить PBS из каждого капилляра, не нарушая поверхность гидрогеля, и добавить свежий объем PBS. По завершении исследования проанализируйте собранные аликвоты PBS с помощью соответствующего метода количественной оценки количества препарата, высвобождаемого в каждый момент времени. Чтобы охарактеризовать термическую стабильность инкапсулированного геля инсулина, загрузите инсулин и тиофлавин Т в гидрогель, как показано на примере, и используйте иглу 21 калибра для впрыскивания 200 микролитров груза и гидрогеля, загруженного зондом, по меньшей мере в три скважины черной 96-луночной пластины на образец.
Затем запечатайте пластину оптически прозрачным клеевым уплотнением для предотвращения испарения и вставьте пластину в считыватель пластин, оснащенный контролем температуры, встряхиванием и кинетическим программированием чтения. Для оценки жизнеспособности инкапсулированной клетки гидрогеля используют иглу 21 калибра для введения 150 микролитров гидрогеля, содержащего соответствующую концентрацию клеток, в каждую из трех скважин на образец в прозрачной нижней 96-луночной пластине и добавляют 100 микролитров соответствующей клеточной среды в каждый объем гидрогеля. В первый день посева замените супернатант на каждом гидрогеле в соответствующий момент времени для каждой группы образцов 50 микролитрами двух миллимоляров раствора Calcein AM.
После 30-минутной инкубации визуализирует центр каждой скважины с помощью конфокальной микроскопии. Чтобы оценить способность инкапсулированных клеток оседать в шприце перед инъекцией, разводят интересующие клетки до одного раза от 10 до шести клеток на миллилитр в концентрации PBS и окрашивают клетки 50 микролитрами двух миллимоляров Calcein AM в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце инкубации смешайте клетки с 500-700 микролитрами гидрогеля, как показано на примере, и используйте иглу 21 калибра для введения от 100 до 200 микролитров клетки, содержащей гидрогель, в дно по меньшей мере одной кюветы на образец.
Затем визуалите кюветы, лежащие ровно на боку на сцене конфокального микроскопа сразу после инъекции и через один и четыре часа после посева, чтобы увидеть, осели ли клетки в гидрогеле или они остались подвешенными. Возможности истончения и самовосстановления геля можно наблюдать с помощью протоколов развертки потока и ступенчатого сдвига соответственно. Характеристика модулей накопления и потерь с помощью эксперимента колебательной сдвиговой частоты развертки в линейном вязкоупругом режиме в диапазоне частот от 0,1 до 100 радианов в секунду выявляет твердотоподобные свойства.
Как правило, не должно быть пересечения модулей хранения сдвига и потерь, наблюдаемых на низких частотах для более жестких составов, в то время как для более слабых составов гидрогеля можно ожидать перекрестных событий. Варьирование содержания полимеров в гидрогелях PNP может оказывать непосредственное влияние на диффузию груза через полимерную сеть и скорость высвобождения из материалов. Гидрогели PNP также могут стабилизировать груз, подверженный тепловой нестабильности, значительно продлевая срок хранения груза и уменьшая зависимость от хранения и распределения в холодильной цепи.
Включение мотивов интегрина может быть полезно для адаптации гидрогелей PNP для клеточной терапии. Инкапсулированные клетки могут быть флуоресцентно помечены для облегчения их визуализации и количественной оценки. Например, составы, не имеющие участков адгезии, будут иметь низкую жизнеспособность клеток, поскольку инкапсулированные клетки не могут пролиферировать по сравнению с инкапсулированными клетками и составами с адгезионными мотивами, такими как RGD.
Мы все еще изучаем, как изменения в рецептуре влияют на реологические характеристики и динамическую сетку полимерной матрицы. Мы также используем FRAP для изучения диффузии молекул в гидрогеле. Эти материалы могут быть использованы для того, чтобы задать новые биологические вопросы о том, как устойчивая доставка может повлиять на доставку лекарств, разработку вакцины или иммунотерапию рака.
