我々のプロトコルは、生体材料として使用するためのポリマーナノ粒子ヒドロゲルの処方を容易にする。研究者が翻訳アプリケーションのためにこの資料を開発し、基本的な生物学的問題を探求することを願っています。PNPヒドロゲルは、小径の針とカテーテルを介して容易に注入されるが、注射後すぐに自己治癒する。
これは、長いタイムスケール上の薬物および細胞の非侵襲的制御された送達を可能にする。この技術は、がんから組織再生、受動的な予防接種にまで広範な荒れ狂う状態に影響を及ぼす、局所的な治療と拡張薬物放出の境界を押し広げる。ナノ沈殿によってナノ粒子を合成するには、PEG-PLAポリマーの50ミリグラムを8ミリリットルガラスシンチレーションバイアルに加え、バイアルに1ミリリットルのアセトニトリルを加える。
完全に溶解する渦。次に、小さな攪拌バーを備えた20ミリリットルのガラスシンチレーションバイアルに10ミリリットルの超純水を加え、1分間に600回転に設定された攪拌プレートにバイアルを置きます。200マイクロリットルのピペットを使用して、水のバイアルに滴下するポリマー溶媒溶液の1ミリリットルを加えます。
コアシェルナノ粒子は、ポリマー溶媒溶液が水全体に急速に分散されるように形成されます。標準プロトコルに従って動的光散乱により粒子サイズを検証します。次にナノ粒子溶液を遠心フィルタユニットに移し、溶液を250マイクロリットル未満に濃縮し、適切なバッファー内のナノ粒子を再懸濁させる。
ヒドロゲルを調製するには、6%HPMC-C12ストック溶液の333ミリグラムを1ミリリットルのルアーロックシリンジに加え、20%ナノ粒子ストック溶液の500マイクロリットルとPBSの167マイクロリットルを8ミリリットルバイアルに加えます。混合した後、注射針を使用して、希釈されたナノ粒子溶液で別の1ミリリットルルアーロックシリンジを充填し、2つの注射器を肘ミキサーに取り付けます。均質で不透明な白いヒドロゲル材料が形成されるまで、約60サイクルの2つの溶液を混合します。
配合されたハイドロゲルのレオロジー特性を測定するには、選択した幾何学的ギャップに従って適切な量のハイドロゲルを鋸歯状のレオメータプレートの中央に注入し、振動試験と流量試験を使用してサンプルの機械的特性を測定します。ヒドロゲルからの薬物放出を特徴付けるには、まず、エポキシを用いて各チューブの一端をシールしてガラス毛細血管を調製する。エポキシが設定されている場合は、4インチ22ゲージの皮下注射針を使用して、1サンプルあたり最低3本のチューブに100〜200マイクロリットルのヒドロゲルを注入し、200〜300マイクロリットルのPBSをヒドロゲルの各体積に慎重に加えます。
適切な時点で、薬物放出の予想タイムスケールに応じて、針を使用して、ヒドロゲル表面を乱すことなく各毛細血管からPBSを慎重に除去し、PBSの新鮮な量を追加する。研究が完了したら、収集したPBSアリコートを適切な方法で分析し、各時点で放出される薬物の量を定量化する。ゲルカプセル化されたインスリンの熱安定性を特徴付けるために、示されているようにインスリンとチオフラビンTの両方をヒドロゲルにロードし、21ゲージ針を使用して、200マイクロリットルの貨物およびプローブロードヒドロゲルをサンプル当たり黒い96ウェルプレートの少なくとも3つの井戸に注入する。
その後、蒸発を防ぐために光学的に透明な粘着板シールでプレートを密封し、温度制御、振盪および運動読み取りプログラミングを備えたプレートリーダーにプレートを挿入します。ヒドロゲルカプセル化細胞の生存率を評価するには、21ゲージ針を使用して、透明な底96ウェルプレートのサンプル当たり3つのウェルそれぞれに適切な濃度の細胞を含む150マイクロリットルのヒドロゲルを注入し、適切な細胞培地の100マイクロリットルをヒドロゲルの各体積に加える。培養の1日目に、各サンプル群の適切な時点で各ヒドロゲル上の上清を2ミリモルカルセインAM溶液の50マイクロリットルで交換します。
30分間のインキュベーションの後、共焦点顕微鏡で各ウェルの中心を画像化します。封入された細胞が注射器に沈着する能力を評価するために、目的の細胞をPBS濃度で1ミリリットル当たり6個の細胞に10倍に希釈し、室温で10分間2ミリモルカルセインAMの50マイクロリットルで細胞を染色する。インキュベーションの最後に、実証したように500〜700マイクロリットルのヒドロゲルと細胞を混合し、21ゲージ針を使用して、ヒドロゲルを含む100〜200マイクロリットルの細胞をサンプルあたり少なくとも1つのキュヴェットの底に注入する。
次に、注入直後と播種後1時間と4時間後に共焦点顕微鏡のステージで横たわっているキュベットを画像化して、細胞がヒドロゲルに落ち着いたか、または懸濁したままであるかどうかを観察します。ゲルのせん断薄化および自己治癒機能は、それぞれフロースイープおよびステップせん断プロトコルを使用して観察することができる。線形粘弾性体の周波数範囲での振動剪断周波数スイープ実験を用いた記憶および損失モジュリの特性評価は、1秒あたり0.1〜100ラジアンの範囲で固体状の特性を明らかにする。
一般的に、より硬い製剤の低周波数で観察されるせん断貯蔵と損失モジュリのクロスオーバーはあってはならないが、クロスオーバーイベントは、より弱いヒドロゲル製剤のために期待することができる。PNPヒドロゲルのポリマー含有量を変化させることは、ポリマーネットワークを介した貨物の拡散および材料からの放出速度に直接影響を与える可能性があります。PNPヒドロゲルは、熱不安定の影響を受けやすい貨物を安定化させ、貨物の貯蔵寿命を大幅に延ばし、コールドチェーンの貯蔵と流通への依存を低減します。
インテグリンモチーフを含めることは、細胞療法のためのPNPヒドロゲルを適応させるために有用であり得る。カプセル化された細胞は、その可視化および定量化を容易にするために蛍光標識することができる。例えば、接着部位を欠いた製剤は、カプセル化された細胞がカプセル化された細胞およびRGDなどの接着モチーフを有する製剤と比較して増殖しないため、細胞生存率が低い。
製剤の変化が、ポリマーマトリックスのレオロジー特性と動的メッシュにどのように影響するかをまだ探っています。また、FRAPを用い、ヒドロゲル内の分子の拡散を研究しています。これらの材料は、持続的な送達が薬物送達、ワクチン開発または癌免疫療法にどのような影響を与えるかについて新しい生物学的質問をするために使用することができる。
