Эти исследования направлены на обеспечение надежных и воспроизводимых модельных систем для выполнения ориентированных исследований кишечного эпителия. Апикальные органоиды могут генерироваться в больших количествах и обещают высокую пропускную способность скрининга. Монослоями легче манипулировать и они предлагают доступ как к апикальным, так и к базальным признакам.
Убедитесь, что размер органоидов составляет от 150 до 250 микрометров в диаметре, прежде чем начать протокол инверсии. Осторожно удалите и выбросьте среду из каждой скважины, содержащей органоиды, не нарушая купол ECM. Добавьте в каждую лунку по одному миллилитру раствора для диссоциации ледяного холода и высиживают пластину при комнатной температуре в течение одной минуты.
Осторожно смещайте купола, медленно пипетируя покрытым наконечником, заботясь о том, чтобы не нарушить и не фрагментировать органоиды. Переложите органоидную суспензию на пластину, обработанную анти адгезивным раствором, и поместите пластину на шейкер при четырех градусах Цельсия на 30 минут. Через 30 минут снимите пластину и аккуратно пипеткой нанесите раствор вверх и вниз, используя наконечник пипетки в один миллилитр, покрытый антиприцепным раствором.
Поместите тарелку на шейкер при четырех градусах Цельсия еще на 30 минут. Снимите пластину и дайте органоидам отстоять под действием силы тяжести в течение одной-двух минут при комнатной температуре. После того, как органоиды осядет, удалите как можно больше диссоциационного раствора и промыть их, добавив 1,5 миллилитра DMEM F-12.
Дайте органоидам отстойник и удалите супернатант. Затем повторите стирку. Удалите как можно больше DMEM F-12 и добавьте 0,5 миллилитра кишечной органоидной расширительной среды.
Инкубировать в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день выполните частичную смену среды, наклонив пластину под углом от 25 до 30 градусов и удалив среду вдоль стенки скважины, позаботясь о том, чтобы не удалить взвешенные органоиды. Добавьте 0,4 миллилитра кишечной органоидной расширительной среды и высиживание при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех дней.
Если агрегаты сформировались, используйте наконечник пипетки в один миллилитр, покрытый антиприцепным раствором, чтобы срезать агрегаты путем пипетки вверх и вниз 20 раз, прижимая конец наконечника к нижней части пластины. Добавьте один миллилитр предварительно подогретого 0,05% трипсина-ЭДТА для повторного суспендировании органоидов. И тщательно перемешать, чтобы обеспечить равномерность суспензии.
Добавьте еще один миллилитр трипсина-ЭДТА для большого количества клеток или если остается значительное количество ECM. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение пяти-10 минут, затем тщательно перемешать с одной миллилитровой пипеткой, чтобы разрушить органоиды, чтобы они полностью диссоциировали на отдельные клетки или небольшие фрагменты. Для полного диссоциации фрагментов или целых органоидов продолжают инкубацию с трипсином-ЭДТА при 37 градусах Цельсия еще три-пять минут.
Как только органоиды будут достаточно диссоциированы, добавьте равный объем DMEM F-12 и пипетку вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать. Инактивируют трипсин-ЭДТА, добавляя 10% FBS к клеткам. Центрифуга фрагментируется в 200 раз G в течение пяти минут при двух-восьми градусах Цельсия.
Если диссоциированные органоиды не смогли гранулировать клетки тщательно, пипетируя вверх и вниз и центрифугируя их снова. Осторожно удалите как можно больше супернатанта. оставляя только ячейку гранулы.
Повторно суспендировать клетки в 100 микролитрах кишечной органоидной дифференцировки для каждой лунки, которая будет засеяна. Регулировка объема соответствующим образом для больших или меньших размеров скважины. Снимите покрытые покрытием пластины из инкубатора и удалите излишки раствора основы мембранной матрицы из каждой скважины.
Добавьте 100 микролитров клеточной суспензии в верхний лунок каждой клеточной культуры и 500 микролитров кишечной органоидной дифференцировочной среды в нижний лунку. Затем инкубируют при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Заменяйте среду как в верхней, так и в нижней скважинах каждые два-три дня.
Для создания культуры АЛИ удалите среду из верхнего и нижнего колодцев и добавьте свежую кишечную органоидную дифференцировочную среду в нижний колодец, оставив верхний колодец пустым. Кишечные органоиды, культивируемые средой расширения органоидов кишечника, демонстрировали кистозную морфологию. Когда ECM удаляется, некоторые органоиды, как правило, агрегируются в течение первых трех дней и должны быть отслажены, чтобы увеличить количество органоидов.
Кишечные органоиды, культивируемые в ECM, продолжали расширяться и демонстрировать спонтанное образование вторичных почковых структур. Органоиды, сохраняемые в течение пяти дней при отсутствии внеклеточного матрикса, проявляли удлиненные, кистозные и неправильные формы. При выражении атипичных маркеров, таких как виллин и ЗО-1, была обнаружена внешняя сторона эпителия, которая подвергалась воздействию среды.
Встроенные органоиды ECM, окрашенные для ядер, виллина и ZO-1, демонстрируют апикальную базальную полярность, где апикальная сторона была обращена к просвету органоида. После того, как монослой был установлен, клетки образовали плотные соединения и слеженный слой. Слежающийся слой также ориентирует свою вилень, содержащую границу кисти, к апикальной стороне эпителия, образуя мультибелковые комплексы ZO-1 между клетками.
Переход к культуре ALI вызвал дальнейшую дифференцировку с более заметными камеральными клетками, которые были визуализированы окрашиванием для секретируемого белка муцина MUC2 Чтобы вызвать инверсию полярности, крайне важно удалить все ECM без нарушения или фрагментации органоидов. Изменения среды также должны быть сделаны с осторожностью, чтобы избежать удаления каких-либо из взвешенных органоидов. Обеспечение наличия достаточного количества одиночных клеток для создания однослойной культуры является основным фактором, определяющим ее качество.
Апикальные специфические функции, такие как поглощение питательных веществ или взаимодействие патогенов хозяина, теперь могут изучаться в соответствующих системах, которые соответствуют потребностям исследователей.
