С целью исследования целостности кишечного барьера, мы разработали метод для измерения целостности кишечного барьера в мыши малых кишечных органоидов. В отличие от этого, мы ссылаемся на используемую культуру монослойных клеток, наш анализ основан на трехмерных малых кишечных органоидов. Адаптация двухмерного анализа к нашей модели имеет важное значение для ее практичности.
Анализ основан на органоидах, выученных в пробирке, и его применение поможет определить индукторы и ингибиторы целостности кишечного барьера. Регуляции плотных белков соединения является важной особенностью всех эпителиальных клеток. Наш анализ позволяет функционировать и анализ эпителиальной барьерной целостности.
Для измерения барьерной целостности органоидов, изолированных от кишечной ткани мыши, сначала прикрывайте все центрифугированные трубки, которые будут использоваться для хранения органоидов во время процесса покрытия с достаточным количеством 0,1%BSA в PBS, чтобы покрыть все пластиковые поверхности. Немедленно удалите раствор BSA и поместите трубки на лед. Затем оттайте раствор клеточной матрицы и органоидной культуры среды на льду и тщательно удалить культуру среды из каждого колодец 48 хорошо органоидной пластины культуры.
Вымойте каждый хорошо с одним миллилитров холодного PBS перед энергично трубопроводов, чтобы растворить матрицы клеток. Когда относительно однородные клеточные суспензии были получены, мыть органоиды со свежим PBS два раза центрифугации и повторного перерасхода каждой органоидной культуры в 40 микролитров холодной среды. Отмежеваться от крупных органоидных структур через 10 микролитров пипетки наконечник пять раз, чтобы собрать структуры с размером от 40 до 60 микрометров и смешать каждый органоидной подвески с 40 микролитров свежеприготовленных клеточных матричных растворов.
Добавить каждый органоидных клеток матричного раствора подвески в центре отдельных скважин из восьми хорошо камерных coverslip и место слайд на ледяной покров в течение пяти минут. В конце инкубации поместите слайд на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 20 минут, чтобы полимеризация структуры матрицы органоидных клеток, прежде чем добавить 150 микролитров органоидной культуры среды к каждому хорошо в течение 24 часов инкубации в инкубаторе клеточной культуры. В конце инкубации обработать положительно-контрольные скважины 10 нанограммами на миллилитр рекомбинантной гаммы мурина в течение 48 часов.
Для выполнения анализа проницаемости, передача камерной крышки в 37 градусов по Цельсию нагревается инкубационная камера перевернутого конфокального микроскопа и установить углекислый газ камеры до 5%Lock крышки плотно на стадии микроскопа и настроить настройки изображения микроскопа для визуализации органоидов в одном хорошо камеры. Затем добавьте три микролитров свежеприготовленного 100 миллимолярный люцифер желтый в 150 микролитров среднего до одного хорошо в течение одного часа инкубации в микроскоп камеры. В конце инкубации отрегулируйте фокус, чтобы визуализировать люмен эталонного органоида и определите необходимую лазерную энергию для желтого возбуждения Люцифера и соответствующие чувствительности обнаружения прибора для изображения желтого сигнала Люцифера на уровне от 30 до 40% от доступного динамического диапазона прибора.
Кроме того, интенсивность сигнала может быть изменена путем изменения времени экспозиции. Чтобы найти позиции около 10 органоидов с сферической структурой близко к поверхности крышки на колодец дифференциальным интерференционным контрастом живой визуализации, захват органоидов с сопоставимыми диаметрами и фокусировка на центральном ломтике органоидов для изображения люменов. Завехать дифференциальный контраст интерфера и люцифера желтую флуоресценцию каждого положения, чтобы задокументировать форму и аутофлуоресценцию каждого органоида.
Когда все органоиды были изображены, добавить 150 микролитров среды, в том числе Люцифер желтый, чтобы Люцифер желтые колодцы обработки и изображение всех скважин каждые пять минут в течение 70 минут. В конце сеанса визуализации добавьте четыре микролитера свежеприготовленной EGTA к 100 микролитров среды. Добавьте разбавленную EGTA в соответствующие скважины.
Затем завехать флуоресценцию органоидов в каждом хорошо каждые пять минут в течение 30 минут. Будьте уверены, чтобы практиковать обработки и культуры или органоидов заранее, как клеточной жизнеспособности и целостности являются необходимым условием для успеха анализа. В этом репрезентативном эксперименте, после 70 минут лечения Люцифером желтый интралюминальный Люцифер желтая флуоресценция была видна только в органоидах от диких животных типа, обработанных интерферонной гаммой.
Ни нестимулированные элементы управления, ни органоиды, полученные из интерферонного гамма-рецептора-2 нокаутом животных показали интралюминальной Люцифер желтой флуоресценции в конце периода лечения. Добавление EGTA вызвало неспецифическое нарушение целостности кишечного барьера путем секвестрирования плотного соединения со-факторов, в результате чего Люцифер желтый take-up и экспрессии во всех органоидов, независимо от происхождения или условий лечения. Относительные значения интенсивности для люцифера желтый уровень флуоресценции в органоидном люмене и за пределами каждого органоида также может быть количественно.
Обязательно выберите органоиды сопоставимого размера вокруг конфигурации и выберите ось набора так, чтобы вы могли представить себе центральный люмен органоида. В дополнение к использованию веществ, вызывающих нарушение кишечного барьера, мы также можем исследовать стратегии для ингибирования разрушения кишечного барьера. Поскольку эта методология основана на первичных клетках одного животного, она может быть использована для многих анализов, уменьшая количество животных, необходимых для каждого эксперимента.
