Этот протокол описывает первую модель апикального выхода в чашке и является критическим улучшением по сравнению с базальными боковыми энтероидными моделями в чашке при установлении моделирования in vitro потенциальных терапевтических средств, предназначенных для перорального введения. Этот метод позволяет получить доступ к апикальной поверхности энтероидов. Соединения могут быть добавлены в клеточные среды, и соединения принимаются апикально, как они были бы in vivo.
Исследователи, заинтересованные в создании системы воспаления кишечника in vitro для тестирования потенциальных пероральных терапевтических средств, могут найти этот метод особенно полезным. Ткани, полученные из разных возрастов и видов, могут потребовать дальнейшей стандартизации. Таким образом, пациентам при установлении времени изменения полярности может потребоваться.
Для реверсирования полярности 3D энтероидов аспирируют среды из каждой лунки 24 луночной пластины установленных 3D базолатеральных энтероидов. Добавьте 500 микролитров пяти миллимоляров ледяного холода, ЭДТА или PBS в каждую лунку из 24-луночной пластины и осторожно механически нарушите экстракт базальной мембраны или купол внеклеточного матрикса, пипеткой вверх и вниз пять-шесть раз пипеткой P 200. Перенесите содержимое четырех скважин в 15-миллилитровую летописную трубу.
Затем добавьте восемь миллилитров ледяного EDTA слэша PBS в трубку. Перенесите оставшиеся 20 скважин таким же образом. Инкубируйте трубки при четырех градусах Цельсия в течение одного часа на вращающейся платформе или шейкере при 330 об/мин.
После инкубации центрифугируют трубки и выбрасывают супернатант из каждой трубки. Соедините и промывайте гранулы пятью миллилитрами DMEM F12. Затем центрифугируют клеточную суспензию и удаляют супернатант перед добавлением 12 миллилитров среды, свободной от антибиотиков, в трубку, гарантируя, что клеточные гранулы будут повторно суспендированы.
Pippet 500 микролитров энтероидной суспензии в каждую лунку из 24 скважин сверхнизкой крепежной пластины. Инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение двух-пяти дней или до тех пор, пока энтероиды не изменят полярность. В первый день воздержания перенесите содержимое четырех скважин из 24-луночной пластины в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.
Повторяйте для всех желаемых лунок с каждой обработкой в отдельной трубке. Центрифугируйте трубки и повторно суспендируйте гранулы в 300 микролитрах 4% из альдегидного фиксатора при комнатной температуре. Через 30 минут промыть гранулы 500 микролитрами PBS.
Добавьте в пробирки 500 микролитров 0,1% Triton X 100. Инкубировать пробирки в течение одного часа при комнатной температуре. Затем поместите трубки на ротатор или шейкер при 200 об/мин в течение 15 минут при температуре от двух до восьми градусов Цельсия.
После последней инкубации добавьте 500 микролитров 10%NDS в PBS T и инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут. Во время инкубации готовят раствор первичных антител. На следующий день добавьте от 250 до 500 микролитров PBS T в трубки в зависимости от размера гранулы и поместите их на ротатор или шейкер при 200 об/мин в течение одного часа при температуре от двух до восьми градусов Цельсия.
Добавьте 200 микролитров раствора вторичного антитела и инкубируйте трубки при двух-восьми градусах Цельсия в темноте. На следующий день приступайте к монтажу окрашенных апикальных энтероидов, вращая трубки и удаляя 100 микролитров супернатанта. Повторно суспендируют клетки в оставшихся 100 микролитрах супернатанта и переносят клеточную суспензию в 500 микролитровых пробирок.
Центрифугируйте трубки в мини-центрифуге в течение 20 секунд. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах комнатной температуры, а также в пятнах красной нуклеиновой кислоты. После 20 минут инкубации центрифугируют клетки и повторно суспендируют гранулы в 100 микролитрах PBS.
После второй промывки и центрифугирования удаляют 70 микролитров супернатанта и повторно суспендируют гранулы в оставшемся объеме ПБС. Затем перенесите суспензию ячейки на маркированный скольжение крышки 24 на 60 миллиметров. Нанесите 75 микролитров монтажника непосредственно на образец и удалите все пузырьки кончиком пипетки.
После ночного отверждения в темноте нанесите тонкий слой глицерина на крышку, затем установите крышку на стеклянную горку и осторожно прижмите ее к месту. Нажмите, чтобы удалить пузырьки между крышкой и слайдом. Дайте крышке проскользнуть, чтобы установить комнатную температуру в темноте в течение двух часов, прежде чем визуализировать энтероиды с 20-кратным увеличением с помощью конфокального микроскопа.
Для энтероидного лечения установите апикальный некротизирующий энтероколит в модели блюда в течение 24 часов, как описано в текстовой рукописи. Перед выполнением анализа удалите 100 микролитров среды из каждой лунки, оставив оставшиеся 400 микролитров. Добавьте 400 микролитров реагента для анализа жизнеспособности клеток в каждую лунку.
Энергично перемешайте содержимое на пластинчатом шейкере в течение пяти минут при 200 оборотах в минуту, чтобы вызвать лизис клеток. Затем переложите 200 микролитров в одну скважину из 96 скважин с прозрачным дном плиты. Повторите для оставшихся 600 микролитров, создав четыре технические реплики на скважину.
Используя пластинчатый считыватель, способный к люминесценции, записывайте значения с интеграцией 0,25 миллисекунды и сравнивайте относительные значения между обработками. Представительное иммунофлуоресцентное окрашивание контроля подтвердило апикальную локализацию ядер по направлению к просвету и обнаружение злодея на внешнем краю эпителия. По сравнению с контролем, воздействие липополисахарида, альфа-некроза опухоли или гипоксии само по себе не вызывало явных изменений в морфологии грубых клеток E-кадгерина или локализации злодея или флуоресцентной интенсивности.
Лечение липополисахаридом или альфа-некрозом опухоли в сочетании с гипоксией нарушило эпителиальную архитектуру и продемонстрировало значительную потерю адгезии соединения и экспрессии белка границы кисти, выявленную потерей слуха ЭКА и окрашиванием злодеев. Жизнеспособность апикальной клетки определяли в нормоксических или гипоксических условиях. В нормоксических условиях по сравнению с контрольным липополисахаридом или опухолевым некрозом альфа не оказывал существенного влияния на жизнеспособность клеток энтероидов.
Однако значительное снижение жизнеспособности наблюдалось при липополисахариде или альфа-некрозе опухоли в сочетании с гипоксией по сравнению с одной только гипоксией. При установлении апикальной модели в тарелке. Не забывайте хранить ЭДТА в клетке суспензии холодным.
Это усилит изменение полярности и обеспечит правильную сжижение и удаление всех ECM. Другие последующие приложения, такие как QPCR, RNA-seq, вестерн-блоттинг или функциональные оценки барьерной проницаемости, могут быть выполнены дополнительно для характеристики ответа на воспалительную передачу сигналов при гипоксии.
