Физические, наиболее лежащие в основе сердечной фибрилляции и дефибрилляции остаются не полностью понятыми. Оптогенетика может предложить способ получить больше информации о сердечных явлениях в хорошо контролируемой среде. Локальная световая стимуляция с использованием микро светодиодов позволяет внедрять инновации в конкретные области сердечной ткани.
Эта целенаправленная стимуляция является новым инструментом для разработки сердечных щадящих методов антиарифметической терапии. Показанный протокол может быть использован для изучения поведения сердца во время сердечной аритмии и особенно во время прерывания. В перспективе разработанные методики могут быть использованы для изучения более клинически значимых моделей крупных животных.
Перед каждым экспериментом очищайте все трубки полностью деминерализованной водой. Аэрировать растворы для щитовидной железы с карбогеном в течение 30 минут при комнатной температуре и корректировать рН до 7,3 с гидроксидом натрия и соляной кислотой. Нагрейте перфузионную систему до 37 градусов Цельсия с помощью водяного теплового насоса.
Поддерживайте постоянную температуру перфузата в пределах водяной бани, используя дополнительный нагревательный элемент, такой как водонепроницаемый нагревательный кабель. Добавьте 500 миллилитров каждого раствора для щитовидной железы в соответствующий резервуар и деаэрируйте трубки, а также пузырьковую ловушку, пропуская раствор щитовидной железы через перфузионную систему, пока больше не будут видны захваченные пузырьки воздуха в трубках или в пузырьковой ловушке. Продолжайте аэрировать растворы для щитовидной железы в течение всего эксперимента в резервуарах с карбогеном, чтобы гарантировать, что рН перфусата остается стабильным позже во время перфузии.
После удаления сердца выполните тонкую подготовку под стереоскопическим микроскопом. Прикрепите аорту к тупой игле и зафиксируйте сосуд шовным материалом. В качестве контроля введите ледяной раствор щитовидной железы через иглу в сердце и проверьте, что сердце плотно установлено.
Перенесите установленное сердце в перфузионную систему и убедитесь, что перфусат течет, чтобы предотвратить попадание воздуха в сердце, соединяя иглу с пузырьковой ловушкой. Убедитесь, что сердце покрыто раствором щитовидной железы на водяной бане и что оно бьется в течение нескольких минут. Поместите один из электродов ЭКГ как можно ближе к поверхности сердца, чтобы обеспечить хорошее качество сигнала.
Приостановите второй электрод ЭКГ в растворе щитовидной железы, убедившись, что ЭКГ записывается. Разместите микро-светодиодный массив в интересующей области. Измените перфузию на низкий уровень калия щитовидной железы с пенецидом и просмотрите сердце в течение 15-30 минут.
Чтобы вызвать аритмию, освещают сердце светодиодным одним и светодиодным двумя со шлейфом от 20 до 50 световых импульсов с частотой от 25 до 35 герц, длительностью импульса от двух до 15 миллисекунд и интенсивностью света 2,8 милливатт на квадратный миллиметр. Повторяйте процесс до тех пор, пока не будет вызвана аритмия. Как только устойчивая аритмия визуально обнаружена, примените всплеск импульсов с разной шириной и частотой, используя три, шесть или девять микросветодиодов массива при пульсирующем токе в 15 миллиамперных пирсов.
Если аритмия продолжается после пяти испытаний дефибрилляции на основе микро-светодиодных массивов, классифицируйте попытку как неудачную и начните резервную дефибрилляцию, используя светодиод один и светодиод два с одинаковыми временными параметрами. Перфузируйте сердце раствором блеббистатина и подождите, пока не произойдет механическое разъединение, которое выполняется, когда сердце перестает биться, но сигнал ЭКГ все еще измерим. Дайте один миллилитр красителя напряжения, краситель 4-A-N-B-D-Q-P-Q в качестве болюса в пузырьковой ловушке перфузии Лангендорфа и подождите от пяти до 10 минут, чтобы позволить красителю равномерно просматривать сердце.
Включите светодиод три. Сфокусируйте камеру на поверхности сердца и примените оптическую мощность 1,27 милливатт на квадратный миллиметр. Выключите лабораторные огни и начните запись, убедившись, что получается оптический сигнал, путем сравнения частоты полученного сигнала с частотой записанной ЭКГ.
Серия экспериментов с различными частотами, количеством микро светодиодов и длительностью импульсов была протестирована на 11 мышах, демонстрируя, что импульсы от 1 до 20 миллисекунд могут дефибрилляции с различными показателями успеха. Наблюдается значительное увеличение успешности девяти светодиодов с длительностью импульса в одну миллисекунду и 20 миллисекунд при частоте дефибрилляции 18 и 20 герц, что ближе к анализируемой средней частоте аритмии 22,55 всех аритмий с интервалом погрешности плюс-минус четыре точки ноль три герца. Здесь показаны две различные попытки дефибрилляции с частотой 14 герц с их записями ЭКГ и соответствующими спектрограммами.
В примере дефибрилляции с 30 миллисекундными импульсами доминирующая частота аритмии немного увеличивается до начала фотостимуляции. VF превращается в VT, где доминирующая частота падает до 14 герц с последующим неудачным прекращением и возвращением к аритмическому поведению с доминирующей частотой 24 герца. Во втором примере первый сегмент показывает VT с доминирующей частотой 23 герца и его гармоническими компонентами до начала фотостимуляции с шириной импульса 20 миллисекунд.
Третий сегмент демонстрирует успешное завершение, которое приводит к нормальному синусовому ритму с фундаментальной частотой 3,5 герц и результирующими гармониками. Оптическое картирование с помощью высокоскоростных камер показало изменение интенсивности флуоресценции во время одного удара сердца во время нормального синусового ритма. Продолжительность перфузии должна поддерживать все условия, чтобы сохранить сердце здоровым, а именно температуру, значение рН и окисление, которое должно оставаться постоянным.
Особенно важно, чтобы раствор тироида не работал пустым, так как пузырьки воздуха в системе могут повредить сердце. Массив микрореальности обеспечивает большую гибкость. Вы можете нацеливаться на разные места сердца или даже комбинировать несколько массивов в одном эксперименте, чтобы правильно прекратить аритмию.
