Использование протокола в качестве биофизического воздействия различных оптогенетических приводов на активность кардиомиоцитов может быть проверено, чтобы помочь в развитии оптогенетических экспериментов в сердечной ткани и целых сердцах. Объединив технику зажима патча с саркомерным слежением и измерениями силы с помощью углеродного волокна, мы можем изучить влияние фотоактивации GtACR1 на электрику и механику желудочковых кардиомиоцитов. Оптогенетическое ингибирование потенциально может быть использовано для оптической дефибрилляции.
GtACR1 является оптогенетическим инструментом, который позволяет заглушить сердечную деятельность. Этот метод полностью применим к другим областям исследований, таким как гладкие и одноклеточные исследования мышечных клеток. Хотя этот протокол не может быть использован для высокой пропускной способности скрининга, он обеспечивает средства для всестороннего анализа кардиомиоцитов электрической и механической функции.
Итак, как говорится, картина говорит больше, чем тысяча слов. Сколько дополнительно информации мы можем получить в видео? Некоторые из наших инструментов и методов, участвующих в одном myocyte растяжения и в подготовке зонда очень сложные, и это гораздо легче передать их в видео по сравнению с описанием.
После того, как кровь была вымыта из солевого пролитого сердца от девяти до 10-недельного новозеландского белого кролика, переключите перфузат на низкоки кальцийный раствор с высоким содержанием калия и пронзрения сердца еще на две минуты после того, как сердце перестанет биться. Перелив ферментный раствор, начните повторно циркулировать ферментный раствор обратно в резервуар после двух минут пищеварения, и уменьшить скорость до 16 миллилитров в минуту после пяти минут пищеварения. Как только ткань появится мягкой после 40-50 минут пищеварения, отрежьте сердце от канюли и немедленно поместите сердце в блокирующий раствор.
Добавьте блокирующий раствор до тех пор, пока ткань не будет полностью покрыта. Отрежьте правый желудочек и перегородку и раздельте левый желудочек. Удалите папиллярные мышцы и использовать тонкие типсы и пипетку, чтобы аккуратно разобрать ткани, чтобы освободить клетки путем механической диссоциации.
Фильтровать подвеску клетки через сетку с одним миллиметром в квадрате поры и осадок клеток центрифугации. Затем повторно накрывают гранулы кардиомиоцитов в свежем блокирующего растворе. Для эксперимента зажима заплаты, пальто autoclaved coverslips в чашке Petri с 100 микрограммами в миллилитр ламинина немедленно перед культурой клетки.
Для эксперимента с углеродным волокном, пальто Петри блюда с 0,12 грамма на миллилитр Поли-HEMA в 95-пяти этанола к воде раствора. Через 10-15 минут после повторного перерасхода кардиомиоцитов удалите супернатант и повторно потекут клетки в культурной среде. После подсчета, семена клеток на крышку в чашке Петри при целевой плотности 1,75 раза 10 до четырех клеток на миллилитр.
Инкубировать культуры в течение трех-четырех часов при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа. В конце инкубации замените среду из культур обложки свежей средой, содержащей аденовирусный тип 5-го типа для GtACR1-eGFP при множественности инфекции 75. Верните культуры в инкубатор на 48 часов.
Для выполнения эксперимента патч зажим, использовать micropipette шкив тянуть тянуть от 1,7 до 2,5 мегаом патч пипетки из соды извести стеклянные капилляры и инициализировать программное обеспечение для сбора данных. Поместите крышку с клетками в измерительную камеру, содержащую внешний раствор, и выберите кардиомиоцит на основе его флуоресценции eGFP. Затем заполните патч пипетку с внутренним раствором и прикрепить пипетку к держатель пипетки вставки серебра хлорид покрытием серебряной записи проволоки во внутренний раствор.
Установите мембранный тест, чтобы применить 10 милливольтовых импульсов в течение 15 миллисекунд с базовым уровнем нулевой милливольты. Достигнув конфигурации, прикрепленной к ячейке, переключитесь на режим всей ячейки с потенциалом хранения минус 60 милливольт в программном обеспечении для сбора данных. Затем осторожно нанесите отрицательное давление, чтобы получить доступ ко всей конфигурации клетки путем разрыва мембраны.
Об успешном разрыве свидетельствует немедленное увеличение измеренной емкости. Запись протоколов фотоактивации в режиме зажима напряжения при минус 74 милливольтах с световыми импульсами 300 миллисекунд или потенциалом действия в текущем режиме зажима при нулевом пикоампере. Для производства углеродных волокон сначала смонтировать пипетки на держатели пипеток шкив.
Потяните стеклянные капилляры в две пипетки общей конические длины около 11 миллиметров и окончательный внутренний диаметр около 30 микрометров. Далее используйте стерео микроскоп, чтобы выровнять один капилляр в круге ориентации и согнуть его до 45 градусов, нажав вниз на кончике капилляра с бендером. Нагрейте нить до тех пор, пока капилляр не сохранит угол 45 градусов даже после удаления бендера.
После изгиба капилляров используйте тонкие типсы, оснащенные мягкими трубами, чтобы вынуть из трубки одно углеродное волокно и поместить его в тонкую кончик капилляра. Нажмите волокна в капилляре до изгиба. Вырезать углеродных волокон, чтобы они проектировать два миллилитров от кончика капилляров и использовать цианоакрилат клей, чтобы исправить волокна на передней части каждого капилляра.
Чтобы откалибровать волокна, прикрепите одну капиллярную крышку к держателю, управляемому микроманипулятором и мотором пьезо. Перемести капилляр к датчику и выровняй его по отношению к датчику. Поместите кончик волокна в контакт с датчиком силы, не производя никакой силы.
Общее движение двигателя пьезо составляет 60 микрометров. Перемести двигатель пьезо в шесть 10 микрометровых шагов к датчику силы. Датчик имеет чувствительность 0,05 миллинютонов на вольт и диапазон силы от нуля до 0,5 миллинютонов.
Прочитайте измеренное напряжение для каждого шага и удалите углеродное волокно с датчика. Чтобы зафиксировать силу контрактных кардиомиоцитов, покройте поверхность стекловолокна Поли-HEMA и поместите его в измерительную камеру. Заполните камеру внешним раствором ванны.
Прикрепите оба углеродных волокна загружены капилляры к стадии микроманипулятора и выровнять их под углом, так что углеродные волокна находятся вблизи горизонтальной к поверхности измерительной камеры. Чтобы проверить, правильно ли выровнены волокна, сосредоточьтесь на поверхности измерительной камеры, опустите первое волокно и переместите волокно горизонтально. Кончик волокна должен скользить по поверхности измерительной камеры.
Следуйте той же процедуре для второго волокна. С выключенным светом, добавить несколько капель культурной подвески клеток в камеру и применить короткий зеленый свет импульсы, чтобы выбрать клетки, которые контракт в ответ на стимуляцию зеленого света. Чтобы прикрепить первое волокно, аккуратно сжать клетку, понизив волокна затем освободить давление.
Прикрепите второе волокно параллельно первому на другом конце кардиомиоцита, чтобы иметь максимальное количество сармеров между двумя волокнами. После того, как оба волокна будут прикреплены, поднимите волокна так, чтобы клетка больше не соеха была в контакте с поверхностью камеры. Принесите sarcomeres в фокус, установите sarcomere длина отслеживая окно между волокнами, и используйте модуль обнаружения края для того чтобы отслеживать изгиб волокна.
Установите области обнаружения с красными и зелеными окнами и определите порог на первой производной следа интенсивности света. Оптически темп ячейки при отслеживании длины саркомера и изгиба волокна. В этом случае, мы ходить на 0,25 герц.
После записи по крайней мере 15 оптически вызвали сокращения, поле стимулировать клетку электрически. Найдите порог для получения сокращений и примените в 1,5 раза пороговое напряжение для электрического темпа. Для протокола торможения, применять электрические стимулы, чтобы вызвать сокращения, а затем подвергать клетку устойчивый световой импульс при различных интенсивности света.
Запись по крайней мере 15 сокращений после светового ингибирования. GtACR1 выражается в культурных кроличьих кардиомиоцитах. Фотоактивация GtACR1 при интенсивности света в четыре милливатта на миллиметр в квадрате в течение 300 миллисекунд приводит к большим внутренне направленным токам на уровне минус 74 милливольт с измеренным пиковым течением 245 пикоамперов.
В этом репрезентативном эксперименте потенциалы действия запускались либо электрически с текущими инъекциями, в 1,5 раза превышает порог, либо оптически с 10 миллисекундных световых импульсов. Оптически темп кардиомиоцитов продемонстрировали более медленное действие потенциального начала. Электрически вызванные потенциалы действия были ингибированы при устойчивом освещении.
Более высокие текущие инъекции и в 1,5 раза порог во время устойчивого применения света также не вызывают потенциал действия. Кардиомиоцит генерируется сокращение силы 232 микронютонов на миллиметр в квадрате на электрический темп и 261 микронютонов на миллиметр в квадрате после оптического темпа. Длительный зеленый свет импульсы ингибируют сокращения с пост-ингибированием повторения сокращений генерации нижней контрактильной силы в соответствии с диастолической потери кальция от кролика кардиомиоцитов.
Мы рекомендуем практиковать методы перед проведением эксперимента, особенно в том, что позиционирование микробов в темноте может быть сложной задачей. очень важно при анализе кардиомиоцитов контрактности, как это может повлиять на производство силы и релаксации. Различные после нагрузки также могут быть применены для изотонического и auxotonic анализа сокращения.
Эти методы позволяют характеристикировать биофизические эффекты активации недавно разработанных оптогенетических приводов в кардиомиоцитах, что имеет решающее значение для выбора наиболее подходящего оптогенетического инструмента для каждого эксперимента. Пожалуйста, имейте в виду, что аденовирусная трансдукция и все шаги после трансдукции должны быть выполнены в условиях биологической безопасности II уровня.
