Этот протокол может помочь ученым, которые заинтересованы в изучении молекулярной функции астроцитов человека в своей родной нише. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет выделять и обогащать определенный тип клеток, взрослых астроцитов из объемных образцов мозговой ткани человека с использованием флуоресцентно-активированной сортировки ядер. Эта методология может быть применена для выделения других типов клеток из неокортекса человека, таких как нейроны и клетки-предшественники олигодендроцитов с использованием других соответствующих флуоресцентно-конъюгированных антител.
Начните рассечение примерно от 200 до 400 миллиграммов ткани из свежезамороженного образца ткани коры головного мозга взрослого человека. Поместите ткань в семимиллилитровую стеклянную ткань, содержащую четыре миллилитра ледяного лизисного буфера на льду, и измельчите ткань примерно 50 раз. Перенесите гомогенат в 12-миллилитровую ультрацентрифужную полипропиленовую трубку.
Используйте пятимиллилитровую пипетку, чтобы добавить 6,5 миллилитров ледяного буфера сахарозы на дно ультрацентрифужной трубки, не нарушая границу раздела между сахарозой и гомогенатом ткани. Чтобы собрать ядра, ультрацентрифугируйте лизат в течение одного часа при 101, 814 раз G и тщательно аспирируйте супернатант и мусор, не нарушая гранулу. Добавьте 0,1% BSA в PBS в ультрацентрифужную трубку для 10-минутной инкубации на льду перед повторным использованием гранулы ядер.
Затем используйте трипан синий для визуализации интактных ядер под световым микроскопом и для обеспечения того, чтобы концентрация была выше 10 до пятого ядра на миллилитр Для флуоресцентно-активированной сортировки изолированных ядер добавьте примерно 20 микролитров повторно суспендированного образца к раствору антител, содержащему Alexa fluor 555 конъюгированного мышиного анти-NeuN антитела. Добавьте приблизительно 20 микролитров повторно суспендированного образца к раствору антител, содержащему APC-конъюгированное мышиное антитело против PAX6. После часовой инкубации при четырех градусах Цельсия с встряхиванием, защищенным от света, добавьте DAPI в соотношении 1:1000 ко всем образцам и контрольной группе.
Чтобы включить ядра соответствующего размера и исключить эритроциты и мусор, используйте контрольную трубку, чтобы загнать клетки в их передние и боковые области рассеяния. Чтобы выбрать популяцию синглетных ядер, затвор по прямой области рассеяния против прямой ширины рассеяния или высоты и области бокового рассеяния против ширины или высоты бокового рассеяния. Gate by DAPI для включения только интактных ядер синглетов и для исключения любых обломков и дублетов.
После обработки в соответствии с любыми дополнительными флуоресцентными элементами управления запустите контрольный образец, предназначенный только для DAPI. Запустите элемент управления NeuN Alexa fluor 555, чтобы определить отсечку для NeuN-положительного окрашивания в канале Alexa fluor 555. Запустите элемент управления PAX6 APC только для определения отсечки для PAX6-положительного окрашивания в канале APC.
После того, как все контрольные элементы были запущены, затвор NeuN-положительные клетки для сбора нейронов и GATE PAX6-положительные клетки с NeuN-отрицательной популяцией для сбора астроцитов. Выйдите и соберите любые дополнительные глиальные популяции, представляющие интерес, из NeuN-отрицательной PAX6-отрицательной популяции. Для объемного одноядерного секвенирования РНК после сбора от 50 000 до 500 000 ядер в 0,04% PBS, дополненном BSA, добавляют в образец два миллилитра раствора сахарозы, 50 микролитров одномолярного хлорида кальция и 30 микролитров одномолярного ацетата магния.
Доведите конечный объем суспензии до 10 миллилитров с PBS. Перемешайте содержимое пробирки путем инверсии и инкубируйте реакцию на льду в течение 15 минут. Гранулируют ядра центрифугированием и повторно суспендируют ядра в одном миллилитре реагента, экстрагирующего РНК.
Затем вихрьте трубку, заморозьте образец на сухом льду и храните ядра при минус 80 градусах Цельсия. Для объемного одноядерного транспозазно-приемлемого секвенирования хроматина соберите от 50 000 до 75 000 ядер в 0,04% PBS, дополненный BSA, в микроцентрифужной трубке, покрытой 5% BSA, и заморозьте ядра до их последующего анализа. Популяции нейрональных, астроцитарных и олигодендроцитарных ядер-предшественников могут быть отсортированы из свежезамороженного посмертного образца височной неокортекса человека, как показано на рисунке.
Исследования секвенирования одноядерной РНК дополнительно определили приоритет PAX6 в качестве верхнего дифференциально экспрессируемого фактора ядерной транскрипции как в протоплазматических, так и в волокнистых субпопуляциях взрослых астроцитов. После сортировки могут быть охарактеризованы специфические для типа клеток изменения транскриптома в первичной патологической эпилепсии неокортекса. В этом анализе транскриптомный анализ подтвердил, что PAX6-положительные NeuN-отрицательные популяции были надежно обогащены маркерами панастроцитов и истощены для нейронных маркеров.
Иммунофлуоресцентное окрашивание может быть использовано для подтверждения совместной локализации PAX6 с глиальным фибриллярным кислым белком в корковых астроцитах человека. Более короткие посмертные интервалы связаны с большим восстановлением интактных ядер из свежих образцов тканей. Высокий выход интактных ядер может быть извлечен из замороженной ткани до 24 часов после вскрытия, но через 30 часов очень немногие интактные ядра могут быть восстановлены.
Самое главное, что нужно помнить, это получить PAX6-положительную популяцию из NeuN-отрицательной популяции, потому что есть нейроны, которые также экспрессируют PAX6, и мы хотим исключить их. Этот метод также позволил изучить астроциты в хирургических образцах головного мозга эпилепсии, дополнительно выявив молекулярную дисрегуляцию астроцитов человека в контексте конкретной патологической ниши.
