Общая цель протокола состоит в том, чтобы изолировать первичные клетки микроглии от живых тканей мозга взрослого человека. В нашем случае, это было собрано как хирургическое окно во время операции. Это достигается путем первоначального сбора тканей мозга в ледяной PBS, ткани затем кубиками на 1 мм куб мелкие кусочки, и я только что сделал с помощью трипсина EDTA.
После этого клетки собирают центрифугацию и помыли в колбе, пригодной для культуры клеток андрогенов в течение 48 часов. Клетки собирают еще раз из колбы и культивированы до дальнейшего использования. Первичные клетки микроглии человека теперь можно охарактеризовать с помощью иммуноцитохимии и использовать для дальнейших экспериментов.
Основным преимуществом нашего протокола для изоляции клеток микроглии из тканей мозга взрослого человека является то, что он эффективно обеспечивает первичные клетки микроглии взрослого человека очень рентабельным способом. Протокол является надежным и уменьшает потерю ячеек за счет сокращения количества шагов, используемых в существующих протоколах. Соберите ткань в 50-мл Сокол трубки, содержащей 10 мл ледяного aCSF.
Протрите трубку сбора тщательно с 70% алкоголя и передачи в асептический ламинарный поток воздуха камеры. Откажитесь от aCSF тщательно и взвесить ткани в трубке Сокола. Рассчитайте приблизительно вес ткани, вытемив вес пустой трубки Falcon.
Теплый свежий aCSF до 37 градусов по Цельсию. Держите ткань в тепле aCSF в течение пяти минут. Этот шаг имеет решающее значение, чтобы избежать смерти клеток.
Отбросьте aCSF тщательно. И мыть ткани один раз с 1X PBS нагревается до 37 градусов по Цельсию. Убедитесь, что вся кровь смывается с повторными PBS моет по мере необходимости.
Инкубировать ткань в теплом PBS в течение 5 минут. Отбросьте половину PBS тщательно. Передача ткани вместе с оставшимися PBS в стерилизованную чашку Петри.
Удалите оставшиеся PBS тщательно с 1-мл пипетки. Это предотвратит потерю тканей. Нарезать кубиками, что вопрос, по крайней мере 1-мм куб мелкие кусочки с помощью стерильного скальпеля.
Добавьте 2 мл 0,25% трипсина EDTA в чашку Петри и тщательно вымойте тарелку с помощью пипетки. Перенесите нарезанную кубиками ткань в 50-метровую трубку Falcon, содержащую 10 мл на грамм ткани 0,25% трипсина EDTA. Смешайте с помощью пипетки через 10-мл серологических пипетки.
Инкубировать трубку на шейкере в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию и скорости 250 об/мин. Добавьте 10 мл нейтрализующих средств для нейтрализации трипсина. Тщательно перемешать с серологическим пипеткой 10 мл.
Центрифуга трубки при 2000G при 4 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Отбросьте супернатант и повторно посовелайте гранулы в 1 мл среды культуры. Положите клетки в колбу T25 подходит для клеток андрогенов и добавить 4 мл дополнительной среды культуры.
Культура среды будет содержать 20%L929 супернатант и 1%streptomycin. Рекомендуется добавлять супернатант L929 отдельно в колбы вместо добавления в среду фондовой культуры. Мы закончили с колбой, чтобы однородно распоряжаться ткани.
Избегайте привлечения средств массовой информации на шею колбы во время встряхивания, как это может увеличить шансы на загрязнение. Инкубировать колбу при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2 в течение 48 часов. Соберите средства массовой информации из колбы культуры T25, подготовленной в день 0 в центрифуге труб.
Центрифуга собранных средств массовой информации на 1, 466G при 4 градусах по Цельсию в течение 4 минут. В то время как собранные средства массовой информации в настоящее время центрифугированы, мыть день 0 колбу один раз с 1X PBS. Встряхните колбу осторожно, чтобы удалить любые остатки фрагментов ткани слева.
Избегайте резких встряхивания колбы, как и любые остатки фрагментов не будет негативно влиять на культуру. Добавьте 5 мл свежих культурных медиа в колбу. Откажитесь от супернатанта из центрифугированных трубок.
Добавьте 1 мл среды культуры в одну из трубок и тщательно перемешайте с пипеткой. Серийно добавляйте смешанные средства массовой информации с клетками в другие трубки и тщательно перемешивайте. Положите клетки в отдельную колбу T25, подходящую для клеток андрогенов.
Добавьте 4 мл свежих культурных медиа в колбу. Инкубировать обе колбы при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2 в течение 48 часов. Откажитесь от мультимедиа как из колб, так и добавьте свежие средства массовой информации культуры 5 мл.
Инкубировать колбы при 37 градусах по Цельсию при 5%CO2 в течение 48 часов. На шестой день клетки будут готовы к дальнейшим экспериментам. На изображениях, представленных здесь.
Первая панель секции А астроциты окрашены GFAP, зеленого цвета. Во второй панели, раздела микроглии пятно с RCA, зеленый цвет. В разделе B микроглии окрашены RCA, который зеленого цвета, и астроциты окрашены в GFAP, красный цвет.
Наложение изображений показывает микроглии и астроцитов вместе. Из изображений ясно, что большинство клеток в культуре подготовлены микроглии. Изображения были количественно ослепленный контроль и результат представлен в разделе C.Результаты показали, что около 80% клеток в культуре подготовлены клетки микроглии.
Этот метод может быть выполнен примерно за полтора часа. После этой процедуры должно быть хорошее понимание того, как я могу выбрать грунтовки микроглии из взрослых тканей человеческого мозга, которые могут быть дополнительно использованы для вниз по течению экспериментов.
