Этот протокол предлагает простой и быстрый подход к скринингу чернил биоматериала-кандидата на потенциальные цитотоксические эффекты против чувствительных первичных и иммунных клеток до сложных экспериментов по 3D-биопечати. После инкубации иммунных клеток на конструкциях чернил биоматериала клетки могут быть легко извлечены из конструкций путем бережного промывания для выполнения последующего анализа цитотоксичности или биомаркеров. Этот протокол имеет непосредственное отношение к тканевой инженерии, в которой биопечатные ткани, предназначенные для трансплантации, должны быть построены из первичных клеток и биосовместимых чернил биоматериала.
Для начала подготовьте картридж с биочернилами для установки на биопринтер INKREDIBLE+3D. Во-первых, снимите синие торцевые колпачки с трехмиллилитрового картриджа биоматериала и прикрепите стерильную коническую биопечатную насадку 22 калибра к концу замка Luer картриджа для биочернил. Подключите трубку подачи воздуха для печатающей головки one или PH1 к противоположному концу картриджа и вставьте картридж с прикрепленным коническим соплом для биопечати в вертикальный слот PH1.
Затем плотно установите картридж в PH1 с коническим соплом для биопечати, простирающимся под печатающей головкой. Затяните винт на PH1 по часовой стрелке до тех пор, пока палец не затянется, чтобы зафиксировать картридж с биочернилами на месте. Обратите внимание, что 3D-биопечать может быть выполнена с PH2, оставленным пустым.
Включите биопринтер и запустите программное обеспечение биопринтера на ПК, подключенном к 3D-биопринтеру через кабель USB 2.0. В программном обеспечении нажмите кнопку подключения, чтобы синхронизировать его с 3D-биопринтером. Наблюдайте за тремя опциями в главном меню управления 3D-биопринтера.
Сначала подготовьте биопечать. Во-вторых, меню утилит. И в-третьих, экран состояния.
Выберите параметр подготовки биопечати, затем прокрутите вниз до и выберите параметр домашних осей. После успешной калибровки осей XYZ высота печатного слоя немного уменьшится, а печатающие головки переместятся над центральной точкой печатного слоя. Чтобы приступить к калибровке начальной точки для биопечати в 24-луночных пластинах, снимите стерильную 24-луночную культуральную пластину с ее герметичной пластиковой упаковки и отметьте точку в центральной точке скважины D1 на нижней стороне пластины постоянным маркером.
Снимите крышку пластины и поместите 24-луночную культуральную пластину на печатный слой с колодцем D1, расположенным в переднем левом углу печатного слоя. В главном меню управления выберите меню утилит и переместите ось. Перемещайте печатающие головки с шагом в один миллиметр вдоль осей X и Y до тех пор, пока коническое сопло биопечати PH1 не окажется непосредственно над точкой, отмеченной под скважиной D1. При необходимости точно настройте положение конической биопечатной насадки над точкой, перемещая печатающие головки с шагом 0,1 миллиметра.
Запишите координаты X и Y конической биопечатной форсунки непосредственно над центром скважины D1, как указано на экране панели управления 3D-биопринтера, и отметьте координаты. Затем поднимите печатный слой с шагом в один миллиметр до тех пор, пока дно колодца D1 почти не коснется конической биопечатной насадки, установленной в печатающей головке. При необходимости выполните тонкую настройку движения печатного слоя с шагом 0,1 миллиметра.
В меню утилит выберите параметр калибровки оси Z, а затем выберите и подтвердите параметр калибровки хранилища Z. Вернитесь в главное меню и выберите опцию подготовки биопечати. Прокрутите вниз до и выберите параметр калибровки Z.
Обновите геометрический код 24-луночной пластины или G-код с правильными координатами начальной точки. Откройте предоставленный файл G-кода на 24 скважины в программном обеспечении для биопечати. Обновите координаты X и Y в первой строке со значениями, полученными на предыдущих шагах, и сохраните файл под новым именем.
Убедитесь, что пневматический насос плотно подключен к заднему воздухозаборному порту биопринтера INKREDIBLE+3D, и включите его. Вытащите переднюю ручку управления, расположенную на правой стороне биопринтера INKREDIBLE+3D. Убедитесь, что цифровые манометры для PH1 и PH2, расположенные на передней панели биопринтера, считывают около нуля килопаскалей.
Медленно поворачивайте переднюю ручку управления по часовой стрелке, пока давление, указанное на левом манометре для PH1, не достигнет 12 килопаскалей. Поместите сложенную папиросную бумагу или кусок водонепроницаемой уплотнительной пленки под сопло для печати установленного картриджа, стараясь не прикасаться к печатному соплу. В главном меню управления на 3D-биопринтере выберите подготовить биопечать.
Перейдите к пункту и выберите Включить PH1. Обратите внимание, что биочернила начинают выдавливаться из печатного сопла. При необходимости увеличьте давление экструзии, вращая ручку управления по часовой стрелке до тех пор, пока биочернила не будут экструдированы в непрерывную нить, и запишите новую настройку давления.
Выберите отключить PH1, чтобы остановить экструзию биочернил. Извлеките папиросную бумагу или пленку, содержащую экструдированные биочернила, с печатного слоя и закройте дверцу биопринтера. Для выполнения 3D-биопечати прямолинейных гидрогелевых подложек в формате пластины с 24 лунками выберите меню утилит из главного меню управления, затем выберите отключить SD-печать, которая позволит программному обеспечению биопринтера передавать файлы G-кода на 3D-биопринтер для печати.
Нажмите на кнопку загрузки в программном обеспечении биопринтера и выберите обновленный файл G-кода пластины на 24 скважины. На правой панели управления в программном обеспечении выберите вкладку предварительного просмотра и нажмите кнопку печати, чтобы начать биопечать в скважине D1. По завершении биопечати прямолинейных конструкций накройте крышкой 24-луночную пластину и переместите ее в шкаф биобезопасности класса II. Погрузить каждую прямолинейную конструкцию в две капли стерильного 50-миллимолярного раствора кальция хлорида и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.
Осторожно аспирируйте раствор хлорида кальция из каждой конструкции скважины и промывайте один раз в один миллилитр 1X PBS, чтобы удалить избыток хлорида кальция. Чтобы предотвратить обезвоживание биопечатных гидрогелевых конструкций, поддерживайте 3D-биопечатные прямолинейные конструкции в свежем 1X PBS до тех пор, пока тучные клетки, полученные из костного мозга, не будут готовы к посеву на конструкции. На основе параметров прямого и бокового рассеяния БММК, проанализированных с помощью проточной цитометрии, было отмечено, что гидрогелевая субстрата с самой высокой концентрацией ЧПУ не изменяет нативный размер или гранулярность БММК по сравнению с БММК, культивируемыми в отсутствие гидрогелевых субстратов С ЧПУ агарозы D-маннитола.
Проточный цитометрический анализ проницаемости BMMC для йодида пропидия показал, что ни одна из протестированных концентраций чпу не оказала какого-либо неблагоприятного влияния на жизнеспособность BMMC. Агарозный субстрат с ЧПУ увеличивал экспрессию биомаркеров тучных клеток при концентрациях ЧПУ более или равных 2,5%Однако уровни экспрессии этих рецепторов оставались относительно стабильными между 2,5% и 12,5% ЧПУ, что предполагает эффект, не зависящий от концентрации ЧПУ. Анализ XTT показал, что метаболическая активность BMMMc, культивируемых на 3D-биопечатных гидрогелевых каркасах, оставалась относительно стабильной примерно на 100% во всех проверенных временных точках.
Аналогичным образом, анализы высвобождения LDH и исключения красителей PI не выявили существенных изменений в жизнеспособности BMMC. Тщательное внимание к выбору датчика печати сопла, калибровке осей 3D-биопринтера и настройке давления экструзии обеспечит воспроизводимую печать высококачественных 3D-конструкций. Легкость, с которой тучные клетки могут быть извлечены, позволяет исследовать их с помощью широкого спектра биологических анализов для дальнейшего изучения любого аспекта их клеточных функций.
