Представленный протокол используется для высокопроизводительного скрининга и идентификации ингибирующих и неингибирующих нанотел, нацеленных на электрогенные транспортеры, восстановленные в протеолипосомах или присутствующие в мембранных везикулах. Проектирование анализов переноса может быть затруднено в нескольких случаях, особенно если маркированные субстраты недоступны. Если та же электрофизиология позволяет изучать влияние нанотел на транспорт практически для любого электрогенного транспортера, то электрофизиология SSM не требует меченых подложек.
Нанотела были исследованы для их использования в медицинских приложениях. Этот метод может помочь экранировать потенциальные ингибиторы, нацеленные на конкретные электрогенные транспортеры людей или патогены человека. Для начала возьмите 10 чистых трубок и переложите 10 миллилитров неактивирующей твердой мембраны, или SSM, буфера в каждую трубку.
Чтобы подготовить активирующие буферы SSM, добавьте подложку в пробирки, используя ряд концентраций вокруг ожидаемой половинной максимальной концентрации. Запустите программное обеспечение SSM и позвольте машине инициализироваться автоматически. Задайте путь сохранения данных.
Подтвердите, нажав кнопку OK. Выберите стандартный протокол начальной очистки в параметрах рабочего процесса и нажмите кнопку Выполнить. Затем установите чип с протеолипосомным покрытием на гнездо.
Переместите руку, чтобы заблокировать чип. Заключите смонтированный чип в колпачок. Выберите программу CapCom в рабочем процессе, и дайте ей запуститься для определения проводимости и емкости.
Подтвердите, что проводимость ниже пяти наносименов, а емкость составляет от 15 до 35 нанофарад, прежде чем использовать ее для измерения. Переложите активирующие растворы во флаконы и поместите буферы в пробоотборник. Переместите неактивирующийся буфер в резервуар и поместите его рядом с держателем чипа в положении резервуара справа.
Создайте протокол для рабочего процесса, используя последовательность неактивирующих, активирующих и неактивирующихся последовательностей решений или последовательность BAB в цикле, который выполняет три измерения и переходит к следующему активирующему буферу для всех 10 буферов. Используйте скорость потока по умолчанию 200 микролитров в секунду с одной секундой, одной секундой, одной секундой и одной секундой для последовательности BAB и нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать измерение. Сохраните протокол и позвольте рабочему процессу запуститься, нажав на кнопку воспроизведения.
Затем выполните тот же эксперимент с использованием безбелковых липосом. Используйте любое предпочтительное программное обеспечение для анализа данных для построения измеренного тока в сравнении со временем и используйте функцию для оценки пиковой высоты в диапазоне добавления активирующего буфера. Постройте график пикового тока против концентрации субстрата, чтобы определить половинный максимальный эффект концентрации, или EC50, субстрата с помощью нелинейной регрессии.
Перенесите 50 миллилитров неактивирующего буфера SSM в чистую трубку. Добавьте подложку холина к конечной концентрации в пять миллимоляров и используйте ее для положительного контрольного измерения. Перенесите 10 миллилитров неактивирующего буфера SSM в чистую трубку.
Добавьте подложку холина к пяти миллимолярам и нанотелу до конечной концентрации 500 наномоляров. Повторите шаг для каждого нанотела, чтобы подготовить активирующие растворы, как показано на рисунке. Запустите машину SSM и измерьте емкость и проводимость чипа, покрытого протеолипосомой, как показано ранее.
Переложите активирующий раствор без нанотела во флакон и поместите буфер в пробоотборник зонда. Перенесите неактивирующий буфер без нанотела в резервуар и поместите его в пробоотборник зонда. Затем повторите этот процесс для всех растворов, содержащих нанотела с активирующим и неактивирующим раствором.
Создайте протокол для рабочего процесса С помощью последовательности BAB. Создайте петлю, которая выполняет три измерения последовательности BAB с использованием буферов без нанотел, два измерения последовательности BAB с буферами, содержащими нанотело, 120-секундную инкубацию времени задержки с нанотелом и три измерения последовательности BAB с буферами, содержащими нанотело. Сохраните рабочий процесс и запустите его, нажав кнопку воспроизведения.
Затем создайте новый протокол для рабочего процесса, используя последовательность BAB и цикл из пяти измерений, чтобы вымыть обратимо связанное нанотело. Сохраните рабочий процесс и запустите его, нажав кнопку воспроизведения. Сравните последний пиковый ток измерений с первоначальным измерением только подложки.
Если пиковый ток достигает начального значения, нанотело успешно вымывается и исходные условия восстанавливаются. В противном случае повторите рабочий процесс или перейдите на новый чип. Повторите этот процесс с использованием отдельных чипов для каждого экрана нанотел или повторите с несколькими нанотелами, используя один и тот же чип.
Используйте любое предпочтительное программное обеспечение для анализа данных, чтобы построить измеренный ток по отношению ко времени. Затем программа автоматически выбирает функцию для оценки пиковой высоты в диапазоне добавления буфера активации. Нормализуйте пиковый ток и присутствие нанотела на основе продолжающегося измерения только подложки.
Постройте график пиковых токов в гистограмме и сравните пиковые токи измерений только подложки с пиковыми токами, измеренными в присутствии нанотел, чтобы идентифицировать тормозные нанотела. Переместите 50 миллилитров неактивирующего буфера SSM в чистую трубку и добавьте холин подложки до конечной концентрации пяти миллимоляров и используйте его в качестве активирующего раствора для положительного контроля. Добавляют пять миллилитров неактивирующего раствора в восемь чистых пробирок, затем добавляют в пробирки субстрат холина и ингибирующее нанотело в концентрациях в ожидаемом диапазоне IC50.
Добавьте 10 миллилитров неактивирующего раствора в восемь пробирок и добавьте ингибирующее нанотело к каждой трубке, соответствующей неактивационному буферу. Запустите настройку SSM и измерьте емкость и проводимость чипа, покрытого протеолипосомой. Переложите активирующий раствор без нанотела во флакон и поместите его в пробоотборник зонда.
Затем перенесите неактивирующий буфер без нанотела в резервуар и расположите его в положении резервуара рядом с держателем чипа справа. Переложите активирующие и неактивирующие растворы, содержащие нанотела, во флаконы и расположите буферы в пробоотборнике зонда. Создайте протокол для рабочего процесса с помощью последовательности BAB.
Включите петлю для измерения каждой концентрации дважды, инкубируйте в течение 120 секунд и измеряйте еще три раза. Используйте любое предпочтительное программное обеспечение для анализа данных, чтобы построить измеренный ток в сравнении со временем и выбрать функцию для оценки пиковой высоты в диапазоне добавления буфера активации. Построение пиковых токов против концентрации нанотела для определения IC50 с помощью нелинейной регрессии.
Для определения концентрации субстрата, которая будет использоваться во время скрининга нанотел, электрогенный транспорт измеряли при различных концентрациях подложки для определения EC50. Была выбрана концентрация субстрата, соответствующая условиям насыщения, пять миллимоляров, которая поддерживалась постоянной во всех активирующих буферах. Влияние ингибирующих нанотел на электрогенный транспорт визуализировали по снижению амплитуд пиковых токов.
После запуска протокола промывки, позволяющего развязывать нанотела, наблюдалось восстановление от 80 до 95% от начальной амплитуды пикового тока. При переходе от неактивирующих к активирующим условиям нанотела, присутствующие в этих буферах, не вводили значимых токов артефактов. После отбора нанотел с ингибирующими свойствами определяли значения IC50 для отдельных нанотел.
Крайне важно дать достаточно времени для калибровки протеолипосом на чипе с буфером, содержащим нанотело. Поскольку связывание обратимо, нанотело должно присутствовать как в активирующих, так и в неактивирующих буферах.
