제시된 프로토콜은 고처리량 스크리닝 및 프로테오폴좀으로 재구성된 전기 수송기를 대상으로 하는 억제 및 비억제 나노체의 식별또는 막 소포에 존재하는 데 사용된다. 특히 라벨이 부착된 기판을 사용할 수 없는 경우 여러 경우에 전송 용하를 설계하는 것이 어려울 수 있습니다. 동일한 전기 생리학이 거의 모든 전기 생성 수송기의 수송에 나노 체의 효과를 연구 할 수 있다면, SSM 전기 생리학은 라벨기판을 필요로하지 않기 때문에.
나노 바디는 의학 응용 프로그램에서 그들의 사용에 대 한 조사 되었습니다. 이 기술은 인간 또는 인간 병원체의 특정 전기 생성 수송기를 표적으로 하는 잠재적인 억제제를 스크린하는 것을 도울 수 있습니다. 시작하려면 10개의 깨끗한 튜브를 가지고 각 튜브에 10밀리리터를 전달합니다.
활성화 SSM 버퍼를 준비하려면 예상 반 최대 농도 주위에 일련의 농도를 사용하여 기판을 튜브에 추가합니다. SSM 소프트웨어를 시작하고 컴퓨터가 자동으로 초기화하도록 합니다. 데이터에 대한 저장 경로를 설정합니다.
확인 버튼을 눌러 확인합니다. 워크플로 옵션에서 표준 초기 세척 프로토콜을 선택하고 실행을 클릭합니다. 다음으로, 소켓에 프로테오올리포좀 코팅 칩을 장착합니다.
팔을 움직이면 칩을 잠급다. 장착된 칩을 캡으로 둘러싸습니다. 워크플로에서 CapCom 프로그램을 선택하고 실행하여 전도도 및 커패시턴스를 결정합니다.
전도도가 5 나노시멘 미만이고 정전 용량이 측정을 위해 사용하기 전에 15에서 35 nanofarad 사이인지 확인합니다. 활성화 솔루션을 바이알로 전송하고 프로브 샘플러에 버퍼를 배치합니다. 비활성화 버퍼를 저수지로 옮기고 오른쪽의 저장소 위치에 있는 칩 홀더 옆에 놓습니다.
세 가지 측정을 수행하고 모든 10개의 버퍼에 대해 다음 활성 버퍼로 이동하는 루프에서 솔루션 시퀀스 또는 BAB 시퀀스 의 순서를 사용하여 워크플로에 대한 프로토콜을 만듭니다. BAB 시퀀스에 대해 초당 200 마이크로리터의 기본 유량을 1초, 1초, 1초 의 흐름 시간을 사용하고 플레이를 클릭하여 측정을 시작합니다. 프로토콜을 저장하고 재생 버튼을 클릭하여 워크플로우를 실행하도록 합니다.
그런 다음 단백질이 없는 리포솜을 사용하여 동일한 실험을 수행합니다. 데이터 분석에 기본 소프트웨어를 사용하여 측정된 전류 대 시간을 플롯하고 활성화 버퍼의 추가 범위에서 피크 높이 추정을 위해 함수를 사용합니다. 기판 농도에 대해 피크 전류를 플롯하여 비선형 회귀를 통해 기판의 농도 또는 EC50의 절반 최대 효과를 결정합니다.
작동하지 않는 SSM 버퍼의 50 밀리리터를 깨끗한 튜브로 옮킨다. 기판 콜린을 5 밀리몰러의 최종 농도에 추가하고 긍정적 인 제어 측정을 위해 이를 사용합니다. SSM 버퍼를 활성화하지 않는 10밀리리터를 깨끗한 튜브로 옮킨다.
5 밀리몰라에 기판 콜린을 추가하고 500 나노 몰라 최종 농도에 nanobody. 각 nanobody에 대한 단계를 반복하여 활성 솔루션을 설명하는 대로 준비합니다. SSM 기계를 시작하고 앞에서 설명한 것처럼 프로테오폴솜 코팅 칩의 커패시턴성과 전도도를 측정합니다.
나아무도 없이 활성화 용액을 바이알로 옮기고 버퍼를 프로브 샘플러에 배치합니다. nanobody없이 비활성화 버퍼를 저수지로 옮기고 프로브 샘플러에 배치합니다. 그런 다음 활성 및 비활성 용액을 사용하여 나노바디를 포함하는 모든 솔루션에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
BAB 시퀀스를 사용하여 워크플로에 대한 프로토콜을 만듭니다. 나노체가 없는 버퍼를 사용하여 BAB 서열의 세 가지 측정을 수행하는 루프, nanobody를 포함하는 버퍼를 사용한 BAB 서열의 두 가지 측정, nanobody와의 120초 지연 시간 인큐베이션, nanobody를 포함하는 버퍼를 사용한 BAB 서열의 세 가지 측정을 수행합니다. 워크플로를 저장하고 재생 버튼을 클릭하여 실행하도록 합니다.
다음으로, BAB 서열과 5개의 측정 루프를 사용하여 워크플로우를 위한 새로운 프로토콜을 만들어 가역적으로 결합된 나노 바디를 씻어낸다. 워크플로를 저장하고 재생 버튼을 클릭하여 실행하도록 합니다. 측정의 마지막 피크 전류를 초기 기판 전용 측정과 비교합니다.
피크 전류가 초기 값에 도달하면 nanobody가 성공적으로 세척되고 초기 조건이 다시 설정되었습니다. 그렇지 않으면 워크플로를 반복하거나 새 칩으로 변경합니다. 각 nanobody 화면에 대한 개별 칩을 사용하여이 프로세스를 반복하거나 동일한 칩을 사용하여 여러 나노 바디로 반복하십시오.
데이터 분석을 위해 선호하는 소프트웨어를 사용하여 측정된 전류와 시간을 플롯합니다. 그런 다음 소프트웨어는 정품 인증 버퍼를 추가하는 범위에서 피크 높이 추정을 위한 함수를 자동으로 선택합니다. 진행 기판 전용 측정에 기초하여 피크 전류와 nanobody의 존재를 정규화합니다.
히스토그램에서 피크 전류를 플롯하고 억제 나노 체를 식별하기 위해 나노 체의 존재에서 측정 된 피크 전류에 기판 전용 측정의 피크 전류를 비교합니다. 비작동 SSM 버퍼의 50 밀리리터를 깨끗한 튜브로 옮기고 기질 콜린을 5 밀리몰러의 최종 농도에 추가하고 이를 양성 제어를 위한 활성화 솔루션으로 사용합니다. 8개의 깨끗한 튜브에 비작동용액5밀리리터를 추가한 다음, 예상 IC50 범위의 농도에서 튜브에 기질 콜린과 억제 nanobody를 추가합니다.
8개의 튜브에 비활성 용액의 10밀리리터를 추가하고 비활성화 버퍼에 대응하는 각 튜브에 억제 nanobody를 추가합니다. SSM 설정을 시작하고 프로테오올리포좀 코팅 칩의 커패시턴성과 전도도를 측정합니다. 나아무도 없이 활성화 용액을 유리병으로 옮기고 프로브 샘플러에 넣습니다.
그런 다음 나아무도 없이 비활성화 버퍼를 저수지로 옮기고 오른쪽에 있는 칩 홀더 옆에 있는 저장소 위치에 배치합니다. 나노바디를 포함하는 활성화 및 비활성 솔루션을 바이알로 옮기고 프로브 샘플러에 버퍼를 배치합니다. BAB 시퀀스를 사용하여 워크플로에 대한 프로토콜을 만듭니다.
각 농도를 두 번 측정하고, 120초 동안 배양하고, 세 번 더 측정하는 루프를 포함합니다. 데이터 분석에 기본 소프트웨어를 사용하여 측정된 전류 대 시간을 플롯하고 활성화 버퍼의 추가 범위에서 피크 높이 추정에 대한 함수를 선택합니다. 비선형 회귀를 통해 IC50을 결정하기 위해 nanobody 농도에 대한 피크 전류를 플롯합니다.
나노체의 스크리닝 중에 사용되는 기판 농도를 결정하기 위해, 전기 생성 수송은 EC50을 결정하기 위해 상이한 기판 농도하에서 측정되었다. 포화 조건에 대응하는 기판 농도, 5 밀리몰어, 선택 및 모든 활성화 버퍼에서 일정하게 유지. 전기원전 수송에 대한 억제 나노체의 효과는 피크 전류의 진폭감소로부터 가시화되었다.
nanobody 바인딩을 허용하지 않도록 세척 프로토콜을 실행 한 후, 초기 피크 전류 진폭의 80 ~ 95 %의 회복이 관찰되었다. 비활성 조건에서 활성화 조건으로 변경할 때 이러한 버퍼에 존재하는 나노 체에 의해 중요한 유물 전류가 도입되지 않았습니다. 억제 특성을 가진 나노체를 선택한 후, 개별 나노체에 대한 IC50 값이 결정되었다.
나아무도를 포함하는 버퍼와 칩에 프로테올리포좀의 보정을위한 충분한 시간을 제공하는 것이 중요합니다. 바인딩이 되돌릴 수 있기 때문에 버퍼활성화 및 비활성 모두에 아무도 존재할 필요가 없습니다.
