Меня зовут доктор Шанкари Наир, и я являюсь постдокторантом в отделе радиационной биофизики в отделе ядерной медицины в NRF, iThemba LABS. В этом видео мы продемонстрируем использование автоматизированного анализа фокусов Gamma H2AX на лимфоцитах периферической крови человека для его использования в приложениях пакетной симметрии. Радиационные риски для персонала строго контролируются.
Ионизирующее излучение напрямую влияет на структуру ДНК, вызывая разрывы ДНК. Особенно двухцепочечные разрывы. Одним из самых ранних этапов в процессе распознавания двухцепочечного разрыва ДНК является фоспохорилизация гистонового варианта H2AX и набор репарационных белков.
В этом видео будет описано использование микроскопии для оценки количества гамма-H2AX очагов ren-nucleus с использованием автоматизированной системы сканирования слайдов и платформы анализа, интегрирующей флуоресцентный микроскоп. Лимфоциты выделяют из цельной крови. Разбавьте цельную кровь PBS в соотношении один к одному, затем аккуратно положите разбавленную кровь на один объем среды градиента плотности.
Постепенно наслаивайте кровь, удерживая трубку наклоненной под углом 45 градусов. Переложите суспензию в центрифугу и открутите при комнатной температуре в течение 20 минут при 900 Г. После центрификации образуется четыре слоя. Осторожно перенесите мутный слой, содержащий лимфоциты, в новую стерильную коническую трубку.
Промыть лимфоциты PBS и посчитать с помощью гемоцитометра. После определения общего количества лимфоцитов разбавляют лимфоцит и суспензию до концентрации примерно 800 000 лимфоцитов в одном миллилитре полного RPMI. Образцы и готовы к нашему облучению.
Лимфоциты облучают гамма-лучами из источника кобальта 60, а затем инкубируют в течение одного часа при 37 градусах Цельсия в увлажненном 5% инкубаторе углекислого газа. Для каждого состояния облучения или трубки готовят три слайда. Поместите скольжение в держатель зажима, затем в карту фильтра и, наконец, в воронку.
Закрепите скользящие зажимы и поместите в цитоцентрифугу. Добавьте 250 микролитров клеточной суспензии на каждую воронку и вращайте в течение 30 г в течение пяти минут. Использование цитоцентрифуги имеет важное значение для получения стандартизированных условий на автоматизации слайдов.
После вращения извлеките слайды из клипа, а затем, используя гидрофобное перо, нарисуйте круг вокруг места, где находятся клетки. Теперь, когда слайды сделаны, клетки должны быть прикреплены к слайду, чтобы могло произойти иммунофлуоресцентное окрашивание. Клетки фиксируют с помощью 3%-ного параформальдегида, или PFA, и раствора PBS в течение 20 минут.
После фиксации промывайте слайды в банке Coplin с PBS в течение пяти минут. Затем накройте клетки Triton X, чтобы обеспечить пермеабилизацию. Стадия пермеабилизации удаляет больше липидов клеточной мембраны, чтобы позволить антителам проникнуть внутрь ядра клетки.
С этого момента мы используем блокирующий раствор, изготовленный из 1% BSA в PBS, для мытья слайдов, чтобы уменьшить потенциальное неспецифическое связывание. После трех шагов промывки по 10 минут с 1% BSA и PBS слайды инкубируют при комнатной температуре с одним до 500 первичным антигамма-антителом H2AX в течение одного часа в увлажняющей камере, что легко достигается путем добавления влажной папиросной бумаги в основание прямоугольного ящика для хранения слайдов. После инкубации с первичным антителом отверните жидкость и снова смойте слайды в 1%-ном растворе BSA.
Инкубируйте слайды с разбавленным от одного до одной тысячи вторичных анти-мышиных антител triTC в течение одного часа в увлажняющей камере. Удалите антитело перед выполнением трех 10-минутных промывок в PBS. Накройте банку Coplin алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить воздействие света на протяжении всего этапа стирки.
Удалите слайды и вытрите лишний PBS за пределы гидрофобного круга с помощью беспылевой папиросной бумаги. Наконец, добавьте одну-две капли DAPI, что привело к отказу от монтажной среды и аккуратно накройте слайды скольжением крышки. Убедитесь, что нет захваченных пузырьков воздуха, а затем храните образцы в темном месте при четырех градусах по Цельсию в течение ночи.
Аккуратно протрите слайды 70% этанолом и поместите слайды на автоматизированную сканирующую платформу или слайд-сцену, прикрепленную к осевым микроскопу ZED-2. Выберите настройку классификации на вкладке MetaCyte, чтобы изменить классификатор. Выбранный классификатор будет использоваться системой для сканирования и оценки слайдов, и основан на наборе заранее определенных параметров, которые будут определять, как система отбирает ячейки и оценивает фокусы.
Классификатор может быть оптимизирован и обучен на основе ряда предварительно классифицированных полей изображения. В зависимости от увеличения микроскопа, типа и антител, которые используются для окрашивания, может быть оптимизирован различный классификатор. Поэтому классификаторы обычно варьируются от лаборатории к лаборатории, но мы дадим обзор наиболее основных шагов, которые необходимо учитывать при корректировке установки классификатора.
На вкладке Захват можно найти фильтр, который будет использоваться, здесь DAPI и TRITC, с максимальным временем интеграции 1,04 секунды. Последний основан на оригинальном классификаторе, который был предоставлен компанией и позже скорректирован на интенсивность антител и фоновый гамма-сигнал H2AX, или TRITC, в этом конкретном типе клеток, а именно лимфоцитах. На вкладке Экспозиция определяется минимальное время интеграции.
Классификатор всегда будет оставаться в пределах минимального и максимального времени интеграции, что предотвращает чрезмерное или недостаточное воздействие слайда. На вкладке «Выделение ячеек» были определены минимальная и максимальная области объектов на основе размера и формы анализируемых ячеек. Например, заранее определенное значение вогнутости и соотношение сторон специфичны для лимфоцитов, которые обычно имеют круглую форму.
На вкладке «Функции» вы можете изменить представление галереи и гистограммы, а также определить, что нужно для оценки микроскопа. Система может оценивать множество предметов, в зависимости от функций, выбранных пользователем. Примером является пороговое значение того, как программное обеспечение оценивает отдельные объекты.
После того, как подходящий классификатор был определен, выберите настройку на боковой панели и присвойте каждому слайду уникальное имя, а затем выберите соответствующий классификатор. Выберите «Максимальное количество ячеек» и добавьте максимальное количество ячеек, необходимое для сканирования. Поиск прекращается, даже если выбранное окно поиска еще не было полностью отсканировано, как только достигнуто максимальное количество ячеек.
Для применения биодиссимметрии достаточно автоматического подсчета 1000 клеток на слайд, учитывая, что подготовлено три слайда на образец крови. Нажмите кнопку ОК, чтобы подтвердить настройки. Чтобы отсканировать слайды, выберите Поиск'на боковой панели.
Если в настройках слайда была выбрана настройка Окно ручного поиска, откроется строка для определения области сканирования. С помощью 10-кратной цели прямоугольная область поиска на слайде выбирается в интерактивном режиме путем фиксации двух углов поля поиска щелчком левой кнопки мыши. Это можно подтвердить с помощью кнопки OK'.
Отрегулируйте начальное положение фокуса. Программное обеспечение будет запрашивать фокус и центрировать опорное ядро, используя цель 40 раз для каждого слайда и подтверждать настройки с помощью OK. Система будет автоматически перемещаться во все стороны последовательно. При необходимости настройте настройку Live Image 'и время интеграции' для этого шага.
Проверьте все настройки микроскопа. Убедитесь, что рычаг трубки микроскопа находится в положении, которое направляет весь свет на камеру, и подтвердите системный запрос с помощью OK. Система запускает автофокус сетки в ближайшем к опорному полю положении сетки. Он продолжает фокусировать поле на обычной сетке, двигаясь в меандре к передней и задней части окна поиска.
Сканирование начинается после завершения автофокусировки сетки. Этап перемещается в поле за полем шаблона меандра для сбора данных. При обнаружении ячейки она позиционируется, изображение галереи сохраняется и отображается на экране, а количество ячеек обновляется.
Поиск прекращается, если весь поиск был отсканирован, если достигнуто максимальное количество ячеек или если поиск был отменен. Когда сканирование будет завершено, щелкните правой кнопкой мыши на панели внизу и откройте образец. Просмотрите галерею, которая состоит из небольших изображений обнаруженных клеток.
В этом окне вы можете указать ячейки, хранящиеся в галерее, с помощью критерия, который будет выбран из выпадающего меню. Клетки обычно отображаются в том порядке, в котором они были обнаружены. Нажмите на Quality Histogram'или Feature Value Diagram', чтобы дать распределение обнаруженных клеток, а также средние значения и стандартное отклонение оцениваемых очагов.
Здесь мы сравниваем нулевой серый с 1,5 серыми образцами. Обычно это контрольный слайд со средним значением 0,124 фокуса на ячейку, где ячейка не была облучена. В контексте биодиссимметрии это будет означать, что человек не подвергался воздействию высоких доз радиации.
На графике видно, что большинство клеток имеют почти ноль очагов на клетку, и нет стороны нормального распределения. Когда мы сравниваем это с дозой 1,5 грея, ясно видно, что это облученный образец. В контексте биодиссимметрии это нормальное распределение является явным признаком того, что образец подвергся воздействию радиации.
Автоматизированное сканирование достаточно чувствительно для обнаружения очагов, индуцированных при низких дозах. Результаты показывают четкое линейное увеличение количества очагов на клетку с дозой. Автоматизированный метод обнаружения двухцепочечного разрыва ДНК полезен для быстрых и высокопроизводительных применений биологической диссимметрии.
Спасибо за просмотр.
