Меня зовут Джарлат Нэлли, и я являюсь частью исследовательской группы здесь, в Национальном центре болезней животных в Эймсе, штат Айова, и мы работаем над лептоспирозом. Лептоспироз – запущенное заболевание. Это глобальная болезнь.
И действительно, у нас очень ограниченное понимание того, как эта уникальная группа бактерий вызывает инфекцию. Таким образом, сегодняшняя презентация посвящена обзору нового инструмента, который доступен для облегчения оценки патогенных механизмов лептоспироза путем специфического глушения специфических генов, экспрессируемых лептоспирами, с использованием техники, называемой интерференцией CRISPR. Однако способность отбирать колонии ньютонов очень зависит от обеспечения наилучшей среды роста для этих привередливых лептоспир.
Итак, прежде всего, мы собираемся познакомить вас с Риком Хорнсби, который очень кратко представил новую жиму для распространения этих привередливых бактерий. А затем мы познакомим вас с Луи Фернандесом, который расскажет о методологии интерференции CRISPR для подавления целевых генов в лептоспирах. Привет, я Рик Хорнсби.
С момента их идентификации Анадой более 100 лет назад лептоспиры обычно изолировались и размножались при температуре 29 градусов по Цельсию, температуре, которая не отражает ни окружающую среду, ни температуру тела хозяина млекопитающих. 10 лет назад USDA ERS начала исследования улучшений среды лептоспиры, и из этого исследования были разработаны медиа Hornsby-Alt-Nally. Используя эту среду, клиницисты и исследователи смогли быстрее изолировать и размножать лептоспиры из полевых случаев и исследований in vitro при температуре и в среде, которая более близко имитирует хозяина млекопитающих.
Мы продолжаем оптимизировать эту жиму, но в настоящее время HAN продемонстрировала потенциал для значительного улучшения ветеринарных и человеческих клинических исследований in vitro и разработки более эффективных вакцин для профилактики лептоспироза. Привет, меня я Луи Фернандес. До сих пор патогенез лептоспироза оставался недостаточно изученным, в основном из-за отсутствия эффективных и простых в выполнении генетических трубок.
Здесь мы собираемся описать новую технику, называемую интерференцией CRISPR или CRISPRi. И этот метод очень прост, потому что нам нужно только экспрессировать два компонента, один ДНК-связывающий белок, называемый мертвым Cas9 или dCas9, и химерную молекулу РНК, называемую одноводящей РНК. А комплекс dCas9 и направляющая РНК собираются сделать спаривание оснований с нашим геном-мишенью и, следовательно, уменьшить или даже блокировать транскрипцию.
Кроме того, используя недавно описанные носители HAN, мы могли бы резко сократить время формирования колоний для восстановления мутантов. Первым шагом является определение протоспейсера, который будет содержаться в направляющей РНК. Эта последовательность содержит 20 нуклеотидов, которые будут определять спаривание оснований с желаемыми генными мишенями.
Отправьте нуклеотидную последовательность на веб-сервер CHOPCHOP с параметрами, определенными для streptococcus pyogenes, Cas9, и протоспейсера, смежного мотива, NGG. На основе полученных результатов выбирайте протоспейсеры с лучшими баллами в пределах минусового тренда. Мотив NGG не будет включен в окончательную последовательность.
Мы использовали промотор lipL32 для экспрессии одноповодной РНК, которая будет содержать переменные 20 нуклеотидов в пяти простых числах на законсервированном каркасе dCas9. После получения кассеты он будет переведен в PMaOri. плазмида dCas9 в месте ограничения Xma1.
Для конъюгации клетки лептоспир выращивают при 29 или 37 градусах Цельсия в средах HAN. За день до конъюгации донорские выравнивки выращиваются в среде LB, дополненной диаминопимеловой кислотой, DAP и спектиномицином. Далее, в день сопряжения жарить насыщенные культуры E.coli в LB плюс DAP.
Внутри биобезопасной вытяжки собран фильтрационный аппарат, поместив мембранный фильтр поверх стеклянного основания, за которым следует стеклянная воронка объемом 15 мл. Обе части удерживаются вместе этим пружинным зажимом. Затем подключите стекло к вакуумной помпе, добавьте в воронку пять мл культур лептоспиры.
Затем добавьте штамм E.Coli beta 2163, содержащий интересуящую плазмиду. Объем будет варьироваться в зависимости от оптической плотности культуры. Мы стремимся к одина-к-один клеточной пиперсиону.
Поверните вакуумный насос, теперь жидкости мы получим через мембрану и клетки будут концентрироваться поверх нее. Возьмите фильтр и поместите его на пластину EMJH плюс DAP, бикурьерная сторона вверх. Инкубировать пластины при 29 градусах Цельсия в течение 24 часов.
Затем извлеките фильтры из пластин и поместите их в коническую трубку 50 мл. Используйте один мл жидкой среды HAN для извлечения клеток из фильтра путем пипетки. Визуализируйте восстановленные клетки с помощью микроскопии темного поля.
На этом этапе можно увидеть эквивалентное количество E.coli и leptospiras. От 100 до 200 микролитров используются для распространения бактерий на пластины HAN, содержащие спектиномицин. На этом этапе DAP опущен и E.coli не будет расти.
Плиты инкубируют при 37 градусах Цельсия и 3% CO2. Колонии должны быть очевидны от восьми до 10 дней. Колонии Leptospira interrogans немного сложно визуализировать.
Здесь мы показываем заросшие колонии, чтобы их было легче увидеть. Добавьте 100 микролитров жидкой HAN в 1,5 мл пробирок для восстановления мутантов. Рекомендуется брать не менее трех колоний с каждой тарелки.
С помощью наконечника пипетки из пластин будут извлечены отдельные колонии. Ожидается, что Аггер будет взят в одиночку. Колонии следует береть из контрольных пластин, содержащих MTP PMaOri.
плазмида dCas9. А пластины с лептоспирами, содержащие плазмиду как с dCas9, так и с направляющей РНК, предназначенной для гена-мишени. Восстановленные клетки теперь можно визуализировать с помощью микроскопии темного поля, чтобы подтвердить наличие жизнеспособных лептоспир.
После визуализации листьев лептоспират переносят клетки в жидкие среды ХАН, содержащие спектиномицин. После роста культуры клетки теперь могут быть восстановлены для подтверждения заглушения и оценки фенотипа. Если антитела против белков-мишеней доступны, иммуноблот является простой методологией оценки глушения.
Лептоспиры, содержащие pMAOri. dCas9 отдельно или с направляющей РНК Cas оценивают с помощью ПЦР, древесных фланковых грунтовок. Плазмида DMT приведет к полосе примерно из 300 пар оснований, и только вид около 700 достигается, когда присутствует кассета направляющей РНК.
Иммуноблоты с использованием экстрактов цельных клеток выполняются для подтверждения глушения, экспрессия белка lipL32 отменяется в клетках, содержащих плазмиды, экспрессируемые в dCas9 и направляющую РНК, нацеленную на этот ген. Причем и звено А, и звено В отсутствуют в клетках, содержащих направляющую РНК, специфичную для обоих генов. Контрольную губуL41 можно увидеть на всех полосах.
Поэтому мы использовали интерференцию CRISPR на интерроганах лептоспир, мы также использовали ее на нескольких дополнительных патогенных видах лептоспир. Мы использовали его, чтобы заставить замолчать определенные гены, а также заглушить экспрессию небольших некодирующих РНК. Наш исследовательский интерес заключается в понимании патогенных механизмов инфекции, поэтому мы обычно ищем дисперсионные факторы, но, очевидно, вы можете заставить замолчать свой собственный ген выбора и в соответствии с вашей собственной областью исследований.
И, например, это может быть подвижность или понимание того, как лептоспиры сохраняются в окружающей среде, или метаболизм. В любом случае, вы должны быть в состоянии сгенерировать конкретный мутант, который позволит вам выполнить функциональную геномику и понять биологическое значение рассматриваемого гена. Поэтому от всех нас здесь, в Национальном центре болезней животных, мы желаем вам удачи в ваших исследованиях.
