Benim adım Jarlath Nally ve Ames, Iowa'daki Ulusal Hayvan Hastalıkları Merkezi'ndeki araştırma ekibinin bir parçasıyım ve leptospirosis üzerinde çalışıyoruz. Leptospirosis ihmal edilmiş bir hastalıktır. Küresel bir hastalık.
Ve gerçekten, bu eşsiz bakteri grubunun enfeksiyona nasıl neden olduğu hakkında çok sınırlı bir anlayışa sahibiz. Bugünkü sunum, CRISPR paraziti adı verilen bir teknik kullanarak leptospira tarafından ifade edilen belirli genleri özellikle susturarak leptospirozun patojenik mekanizmalarının değerlendirilmesini kolaylaştırmak için mevcut olan yeni bir araca genel bir bakış sağlamakla ilgilidir. Bununla birlikte, newton kolonilerini seçme yeteneği, bu titiz leptospiraslar için en iyi büyüme medyasını sağlamaya çok bağlıdır.
Öncelikle sizi Rick Hornsby ile tanıştıracağız. Ve sonra sizi Louis Fernandez ile tanıştıracağız, leptospira içindeki hedef genleri susturmak için CRISPR girişim metodolojisi hakkında konuşacak. Merhaba, ben Rick Hornsby.
100 yıl önce Anada tarafından tanımlanmasından bu yana, leptospiras tipik olarak izole edilmiş ve 29 santigrat derecede yayılmıştır, bu ne çevreyi ne de memeli konak vücut sıcaklığını yansıtan bir sıcaklıktır. 10 yıl önce, USDA ERS leptospira medyasında iyileştirmeler araştırmaya başladı ve bu araştırmanın dışında Hornsby-Alt-Nally medyası geliştirildi. Bu medyayı kullanarak, klinisyenler ve araştırmacılar leptospiras'ı saha vakalarından ve in vitro araştırmalardan sıcaklıkta ve memeli konağını daha yakından taklit eden bir ortamda daha hızlı izole etmeyi ve yaymayı başardılar.
Bu medyayı optimize etmeye devam ediyoruz, ancak mevcut haliyle HAN, tüp bebek araştırmalarında veterinerlik ve insan klinik izolasyonlarını önemli ölçüde iyileştirme ve leptospirozun önlenmesi için daha etkili aşıların geliştirilmesi potansiyelini göstermiştir. Merhaba, ben Louis Fernandez. Şimdiye kadar, leptospirosis patogenezi, esas olarak etkili ve gerçekleştirilmesi kolay genetik tüplerin eksikliği nedeniyle az araştırılmış kaldı.
Burada CRISPR paraziti veya CRISPRi adı verilen yeni bir teknik tanımlayacağız. Ve bu teknik çok basittir, çünkü sadece iki bileşeni ifade etmemiz gerekir, ölü Cas9 veya dCas9 adı verilen bir DNA bağlayıcı protein ve tek kılavuzlu RNA adı verilen bir kimerik RNA molekülü. Ve karmaşık dCas9 ve kılavuz RNA, hedef genimize baz eşleştirme yapacak ve bu nedenle transkripsiyonun azaltılmasını ve hatta engellenmesini sağlayacaktır.
Ayrıca yeni tarif edilen HAN medyasını kullanarak, mutant iyileşmesi için koloni oluşum süresini büyük ölçüde azaltabiliriz. İlk adım, kılavuz RNA'da yer alacak protospacer'ı tanımlamaktır. Bu dizi, istenen gen hedefleriyle baz eşleştirmeyi tanımlayacak 20 nükleotit içerir.
Streptokok pirojenleri, Cas9 ve protospacer bitişik motifi NGG için tanımlanan parametreleri içeren bir nükleotid dizisini chopchop web sunucusuna gönderin. Sonuçlara göre, eksi eğilim içinde en iyi puanlara sahip protospacers'ı seçin. NGG motifi son sıraya dahil edilmeyecektir.
LipL32 promotörini, korunmuş bir dCas9 iskelesinde beş asal olarak değişken 20 nükleotid içerecek tek kılavuzlu RNA'yı ifade etmek için kullanıyoruz. Kaseti aldıktan sonra PMaOri'ye geri dönecektir. dCas9 plazmid Xma1 kısıtlama sitesinde.
Konjugasyon için leptospira hücreleri HAN medyasında 29 veya 37 santigrat derecede yetiştirilir. Konjugasyondan bir gün önce, diaminopimelik asit, DAP ve spektinomisin ile desteklenmiş LB ortamlarında donör eşitlenmiş hücreler yetiştirilir. Daha sonra, konjugasyon gününde LB artı DAP'taki doymuş E.coli kültürlerini ızgara yapın.
Bir biyogüvenlik başlığının içinde, membran filtresini cam tabanın üzerine yerleştirerek filtrasyon cihazını monte etti ve ardından 15 ML cam hunisi geldi. Her iki parça da bu yay kıskacı ile bir arada tutulur. Daha sonra camı bir vakum pompasına bağlayın, hunisine beş ML leptospira kültürü ekleyin.
Ardından, ilgi plazmidini içeren E.Coli beta 2163 suşunu ekleyin. Hacim, kültürün optik yoğunluğuna göre değişecektir. Bire bir hücre kavallarını hedefliyoruz.
Vakum pompasını çevirin, şimdi membrandan alacağımız sıvılar ve hücreler üzerine yoğunlaşacak. Filtreyi alın ve EMJH plakasına ve DAP'a yerleştirin, iki taraflı taraf yukarı. Plakaları 24 saat boyunca 29 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Daha sonra filtreleri plakalardan kurtarın ve 50 ML konik tüpe yerleştirin. Pipetleme ile filtreden hücreleri kurtarmak için bir ML sıvı HAN ortamı kullanın. Kurtarılan hücreleri karanlık alan mikroskopisi ile görselleştirin.
Bu aşamada E.coli ve leptospiras eşdeğer sayıları görülebilir. Bakterileri spektinomisin içeren HAN plakalarına yaymak için 100 ila 200 mikrolitre kullanılır. Bu aşamada DAP atlanır ve E.coli büyümez.
Plakalar 37 santigrat derece ve% 3 CO2'de inkübe edilir. Koloniler 8 ila 10 gün arasında belirgin olmalıdır. Leptospira sorguyor kolonileri görselleştirmek için biraz zor.
Burada onları görmeyi kolaylaştırmak için büyümüş kolonileri gösteriyoruz. Mutantları kurtarmak için 1,5 ML tüplere 100 mikrolitre sıvı HAN ekleyin. Her plakadan en az üç koloni alınması önerilir.
Pipet ucu kullanılarak, plakalardan tek tek koloniler alınacaktır. Agger'ın tek başına götürülmeleri bekleniyor. Koloniler MTP PMaOri içeren kontrol plakalarından alınmalıdır.
dCas9 plazmid. Ve hem dCas9 hem de hedef gen için tasarlanmış rehber RNA ile plazmid içeren leptospiraslı plakalar. Kurtarılan hücreler artık canlı leptospirasların varlığını doğrulamak için karanlık alan mikroskopisi altında görselleştirilebilir.
Leptospiras'ı terk ettikten sonra, hücreleri spektinomisin içeren sıvı HAN ortamına aktarın. Kültür artışından sonra, hücreler artık susturma onayı ve fenotip değerlendirmesi için kurtarılabilir. Hedef proteinlere karşı antikorlar mevcutsa immünoblot susturma değerlendirmek için düz bir metodolojidir.
pMAOri içeren leptospiras. dCas9 tek başına veya kılavuz RNA Cas ile PCR, ahşap kanat astarları tarafından değerlendirilir. DMT plazmid yaklaşık 300 baz çifti bir bant ile sonuçlanacaktır ve kılavuz RNA kaseti mevcut olduğunda sadece 700 civarında bir bant elde edilir.
Tüm hücre özlerini kullanan immünoblotlar susturma onayı için gerçekleştirilir, lipL32 protein ekspresyözü dCas9'da ifade edilen plazmidleri içeren hücrelerde kaldırılır ve bu geni hedefleyen RNA'ya rehberlik eder. Ve hem A hem de B bağlantısı kılavuz RNA'yı içeren hücrelerde yoktur, her iki gen için de spesifiktir. LipL41 kontrolü tüm şeritlerde görülebilir.
Leptospira sorgulayıcılarında CRISPR paraziti kullandık, ayrıca birkaç ek patojenik leptospira türünde de kullandık. Belirli genleri susturmak ve kodlamayan küçük RNA'ların ifadesini susturmak için kullandık. Araştırma ilgi alanımız enfeksiyonun patojenik mekanizmalarını anlamaktır, bu nedenle tipik olarak varyans faktörlerini belirlemeye bakarız, ancak açıkçası kendi tercih ettiğiniz geni susturabilirsiniz ve kendi araştırma alanınıza göre.
Ve örneğin, bu hareketlilik veya leptospiras'ın çevrede veya metabolizmada nasıl devam ettiğini anlamak olabilir. Her durumda, fonksiyonel genomik gerçekleştirmenize ve söz konusu genin biyolojik önemini anlamanıza izin verecek belirli bir mutant üretebilmelisiniz. Ulusal Hayvan Hastalıkları Merkezi'ndeki hepimizden, araştırmanızda başarılar diliyoruz.
