Этот протокол помогает направлять выбор областей, представляющих интерес для технологий пространственной омики, что позволяет более целенаправленно характеризовать ткани или клеточные популяции. Автоматизированный протокол для выбора ROI в анализах протеомики является более надежным и воспроизводимым, чем ручные протоколы, а использование 50-микрометровых ROI для анализов транскриптомики позволяет профилировать конкретные клеточные популяции. Начните с программирования автостейнера для применения флуоресцентных антител визуализации.
В программном обеспечении autostainer нажмите кнопку «Домой» и выберите «Протоколы». Затем нажмите «Создать/Изменить протоколы» и выберите RUO Discovery Universal в качестве процедуры. Нажмите «Первая последовательность», затем выберите «Депарафиназация», а затем «Депар v2».
Для средней температуры выберите 72 градуса цельсия, затем нажмите «Предварительная обработка» и выберите «Кондиционирование клеток» и резервуар CC1. Для параметра «Очень высокая температура» выберите «100 градусов по Цельсию», затем нажмите «CC1 восемь минут» и продолжайте нажимать, пока не будет выбран CC1 64 минуты. Нажмите «Ингибитор», затем выберите «Ингибитор DISCOVERY» и в поле «Время инкубации» выберите восемь минут.
Затем нажмите «Антитело», а затем «Инкубация высокотемповых антител». Для параметра «Низкая температура» выберите 37 градусов по Цельсию. Для антител выберите АНТИТЕЛО 6 с этикетки дозатора.
В поле Время инкубации Plus выберите 32 минуты. Нажмите на Multimer HRP, затем выберите Multimer HRP Blocker. Затем для блокировки антител выберите «Блокировать Ig».
А для параметра Время инкубации выберите четыре минуты. Затем на Multimer HRP Reagent выберите OMap Anti-Rb HRP, а в поле Время инкубации выберите 16 минут. Затем нажмите на Cy5 и для длительного времени инкубации выберите ноль часов, восемь минут.
Нажмите «Двойная последовательность» и выберите «Денатурация антител». Затем выберите Антитело Denature CC2-1, а для очень высокой температуры выберите 100 градусов Цельсия. Убедитесь, что время инкубации составляет восемь минут.
Затем нажмите на DS Inhibitor и выберите Нейтрализовать. Нажмите на DS Antibody, и для очень низкой температуры выберите 37 градусов по Цельсию. Затем в разделе Антитело выберите АНТИТЕЛО 3 с этикетки дозатора.
А для параметра Плюс Время инкубации выберите 32 минуты. Нажмите на DS Multimer HRP и выберите DS Multimer HRP Blocker. Затем для параметра «Блокировка антител» выберите «Блок Ig», а в поле «Время инкубации» выберите «Четыре минуты».
Затем на Multimer HRP Reagent выберите OMap anti-Ms HRP, а в поле Время инкубации выберите 16 минут. Затем нажмите на DS Rhodamine 6G, и для длительного времени инкубации выберите ноль часов, восемь минут. Нажмите на Triple Stain и выберите TS Antibody Denaturation, затем выберите Antibody Denature CC2-2, а для Very High Temperature выберите 100 градусов по Цельсию.
Убедитесь, что время инкубации составляет восемь минут. Затем нажмите на ингибитор TS и выберите TS Neutralize. Нажмите на TS Antibody, и для Very Low Temperature выберите 37 градусов по Цельсию.
Затем в поле Антитело выберите АНТИТЕЛО 7 на этикетке дозатора, а для Plus Incubation Time выберите 32 минуты. Нажмите на TS Multimer HRP и выберите TS Multimer HRP Blocker. Затем для параметра «Блокировка антител» выберите «Блок Ig», а в поле «Время инкубации» выберите «Четыре минуты».
Далее на Multimer HRP Реагент выберите OMap Anti-Rb HRP, а в поле Время инкубации выберите 16 минут. Затем нажмите на TS FAM, и для длительного времени инкубации выберите ноль часов, восемь минут. Нажмите «Сохранить» и добавьте заголовок к протоколу.
Выберите номер протокола, добавьте комментарий и нажмите «Активный», а затем «Сохранить». Выпекайте приобретенные продавцом парафиновые секции тканей человека в духовке, установленной на 70 градусов Цельсия, в течение 20-60 минут. Во время выпечки слайдов печатайте этикетки, нажав кнопку «Создать этикетку» в программном обеспечении autostainer.
Затем нажмите «Протоколы», выберите номер протокола и нажмите «Закрыть/Распечатать». Добавьте соответствующую информацию на этикетку слайда и нажмите «Печать». Выньте горки из духовки и дайте им остыть до комнатной температуры.
Примените ранее напечатанные наклейки протокола к соответствующим слайдам. Загружайте многоразовые диспенсеры антител антителами в соответствии с номерами этикеток антител. Разводят каждое антитело в указанном разбавителе и праймируют многоразовые дозаторы антител.
Соберите блокирующие, детектирующие и усиливающие предварительно заполненные дозаторы реагентов и поместите их на лоток реагентов прибора. Загрузите слайды в ящики для слайдов и нажмите «Выполняется», а затем «Да». Подтвердите начало запуска, проверив продолжительность выполнения на программном обеспечении autostainer.
На следующий день обеспечьте завершение пробега, наблюдая за зелеными мигающими огнями на слотах ящика слайдов. Затем снимите слайды с инструмента и энергично промойте слайды в 1-кратном реакционном буфере до тех пор, пока жидкий раствор не будет полностью удален. Замените SYTO 13 на SYTO 64 на 5 000 наномоляров, чтобы обеспечить интеграцию флуорофоров.
Разбавьте SYTO 64 в 1x TBS и инкубируйте в камере влажности в течение 15 минут. Используйте FITC для DISCOVERY Fam и установите экспозицию на 200 миллисекунд. Используйте Cy3 для DISCOVERY Родамин 6G и установите экспозицию на 200 миллисекунд.
Используйте Texas Red для SYTO 64 и установите экспозицию на 50 миллисекунд. Укажите SYTO 64 в качестве канала фокусировки и, наконец, используйте Cy5 для DISCOVERY Cy5. Установите экспозицию на 200 миллисекунд и сохраните изменения.
Выпекайте закрепленные формалином секции гранул с парафином в духовке, установленной на 70 градусов Цельсия, в течение 20-60 минут. Сканируйте слайды на платформе пространственного профилирования и выбирайте размеры 50 микрометров и 300 микрометров. Автоматизированный протокол визуализации был разработан путем включения одного элемента управления, чтобы подтвердить, что из соседних каналов не было кровотечения.
Тепловая карта log 2 всех маркеров, включенных в пространственный протеомический анализ, сравнивающий ручной протокол панцитокератина CD 45 черного цвета с автоматизированным 3-плексным протоколом серым цветом, показывает значение Spearman R 0,88. Из 31 антитела, использованного в анализах, 23 антитела имели значение R Spearman выше или равное 0,5. Тепловая карта log 2 выбранных мишеней, включенная в пространственный транскриптомический анализ, сравнивающая ручной протокол пан-цитокератина CD 45 в черном цвете с 3-плексным автоматизированным протоколом в сером цвете, показала различия в этих значениях.
Данные секвенирования для 3-плексного автоматизированного протокола визуализации представили более низкие значения по сравнению с пан-цитокератиновым протоколом ручной визуализации CD 45, что также отражено низкими значениями Spearman R 0,15. Также наблюдалась потеря динамического диапазона при использовании автоматизированного протокола 3-плексной визуализации. Обнаружение малых ROI в протоколе пространственной транскриптомики осуществлялось путем выбора круговых областей, представляющих интерес, при количестве РНК диаметром 50 микрометров и 300 микрометров для выбранных мишеней на разных клеточных линиях, которые были сопоставимы между двумя областями интересующих размеров после нормализации.
Этот протокол для автоматизированных панелей визуализации может быть адаптирован исследователями путем обмена маркерами для разработки панелей, которые точно определяют ROI для ответа на их вопросы пространственной протеомики.
