该协议有助于指导空间组学技术感兴趣区域的选择，从而可以更有针对性的组织或细胞群表征。蛋白质组学测定中ROI选择的自动化方案比手动方案更稳定且可重现，并且使用50微米ROI进行转录组学测定可以分析特定细胞群。首先对自动染色器进行编程以应用荧光可视化抗体。
在自动染色器软件中，单击主页按钮并选择协议。然后单击创建/编辑协议并选择 RUO 发现通用作为过程。单击“第一个序列”，然后选择“脱蜡化”，然后选择“Depar v2”。
对于介质温度，选择 72 摄氏度，然后单击预处理并选择细胞调节和 CC1 储液槽。对于“非常高的温度”，请选择 100 摄氏度，然后单击 CC1 八分钟，并继续单击，直到选择 CC1 64 分钟。单击“抑制剂”，然后选择“发现抑制剂”，对于孵育时间，选择八分钟。
然后点击抗体，然后点击高温抗体孵育。对于低温，选择 37 摄氏度。对于抗体，从分配器标签中选择抗体6。
对于 Plus 孵育时间，选择 32 分钟。单击多聚体 HRP，然后选择多聚体 HRP 阻止程序。然后对于抗体阻断，选择 Gt Ig 阻断。
对于孵育时间，选择四分钟。接下来，在多聚体 HRP 试剂上，选择 OMap 抗 Rb HRP，对于孵育时间，选择 16 分钟。然后单击 Cy5，对于长孵育时间，选择零小时八分钟。
单击双序列并选择抗体变性。然后选择抗体变性CC2-1，对于非常高的温度，选择100摄氏度。确保孵育时间为八分钟。
接下来，单击DS抑制剂并选择中和。单击DS抗体，对于极低温度，选择37摄氏度。然后在抗体中，从分配器标签中选择抗体3。
对于 Plus 孵育时间，选择 32 分钟。单击 DS 多聚体 HRP，然后选择 DS 多聚体 HRP 阻滞剂。然后，对于抗体封闭，选择Gt Ig封闭，对于孵育时间，选择四分钟。
接下来，在多聚体 HRP 试剂上，选择 OMap 抗 MS HRP，对于孵育时间，选择 16 分钟。然后点击DS罗丹明6G，对于长潜伏时间，选择零小时八分钟。单击“三重染色”并选择“TS 抗体变性”，然后选择“抗体变性 CC2-2”，对于“非常高的温度”，请选择 100 摄氏度。
确保孵育时间为八分钟。接下来，单击TS抑制剂并选择TS中和。单击TS抗体，对于极低温度，选择37摄氏度。
然后在抗体中，从分配器标签中选择抗体7，对于加孵育时间，选择32分钟。单击 TS 多聚体 HRP，然后选择 TS 多聚体 HRP 阻滞剂。然后，对于抗体封闭，选择Gt Ig封闭，对于孵育时间，选择四分钟。
接下来，在多聚体 HRP 试剂上，选择 OMap 抗 Rb HRP，对于孵育时间，选择 16 分钟。然后单击 TS FAM，对于长孵育时间，选择 0 小时 8 分钟。单击保存并向协议添加标题。
选择一个协议编号，添加注释，然后单击活动，然后单击保存。在设置为 70 摄氏度的烤箱中烘烤供应商采购的福尔马林固定石蜡包埋人体组织切片 20 到 60 分钟。在烘焙载玻片时，通过单击自动染色器软件中的“创建标签”来打印标签。
接下来，单击协议，选择协议编号，然后单击关闭/打印。在幻灯片标签上添加相关信息，然后单击打印。从烤箱中取出载玻片，让它们冷却至室温。
将先前打印的方案标签应用于相应的幻灯片。根据抗体标签编号将可再填充的抗体分配器装入抗体。在指定的稀释剂中稀释每种抗体，并在可再填充的抗体分配器中灌注。
收集封闭、检测和扩增预填充试剂分配器，并将其放在仪器试剂托盘上。将载玻片装入幻灯片抽屉，然后单击“正在运行”，然后单击“是”。通过检查自动染色器软件上的运行持续时间来确认运行开始。
第二天，通过观察滑动抽屉插槽上的绿色闪烁灯来确保运行完成。然后将载玻片从仪器上取下，并在1x反应缓冲液中用力冲洗载玻片，直到液体盖玻片溶液完全去除。用 SYTO 64 替换 5， 000 纳摩尔的 SYTO 13，以实现荧光团整合。
在 1x TBS 中稀释 SYTO 64，并在湿度室中孵育 15 分钟。将 FITC 用于探索之旅，并将曝光设置为 200 毫秒。将Cy3用于发现罗丹明6G，并将曝光设置为200毫秒。
将德州红用于 SYTO 64，并将曝光设置为 50 毫秒。指定 SYTO 64 作为焦点通道，最后，将 Cy5 用于探索之旅 Cy5。将曝光设置为 200 毫秒并保存更改。
在设置为 70 摄氏度的烤箱中烘烤福尔马林固定石蜡包埋的细胞颗粒切片 20 到 60 分钟。在空间分析平台上扫描载玻片并选择 50 微米和 300 微米的尺寸。自动可视化协议是通过包括“省略一个输出”控件来开发的，以确认没有从相邻通道渗出。
空间蛋白质组学测定中包含的所有标记物的log 2热图将黑色的手动全细胞角蛋白CD 45方案与灰色的自动3重方案进行比较，显示Spearman R值为0.88。在测定中使用的31种抗体中，23种抗体的Spearman R值高于或等于0.5。空间转录组学测定中包含的选定靶标的log 2热图将黑色的手动全细胞角蛋白CD 45方案与灰色的3-plex自动化方案进行比较，显示这些值存在差异。
与全细胞角蛋白CD 45手动可视化方案相比，3-plex自动可视化方案的测序数据呈现较低的值，这也反映在0.15的低Spearman R值上。此外，使用3-plex可视化自动化协议时观察到动态范围损失。空间转录组学方案中小ROI的检测是通过选择直径为50微米和300微米的圆形感兴趣区域来进行的，不同细胞系上所选靶标的RNA计数在归一化后两个感兴趣区域大小之间具有可比性。
研究人员可以通过交换标记来调整自动可视化面板的这种协议，以便开发精确定义ROI的面板，以回答他们的空间蛋白质组学问题。
