Этот протокол демонстрирует условия, необходимые для поддержания функции сетчатки в ex vivo ERG, особенно чрезвычайно чувствительной волны B, продуцируемой ON-биполярными клетками. С помощью ex vivo ERG мы можем измерить функцию различных типов нейронов сетчатки с высоким соотношением сигнал/шум, обеспечивая при этом легкое введение фармакологических агентов. Этот метод особенно поддается количественной оценке эффективности фармакологических средств на функцию сетчатки и заболевания.
Для начала преобразуйте установку многоэлектродной матрицы, подключив держатель образца ex vivo ERG к дифференциальному усилителю через головную ступень. Усилитель должен быть подключен к аналоговому входу интерфейсной платы многоэлектродной системы. Используйте записывающее программное обеспечение для многоэлектродной матрицы для записи и хранения входных данных от ex vivo ERG.
Установите коэффициент усиления дифференциального усилителя на 100 и добавьте дополнительное 10-кратное усиление напряжения, в зависимости от спецификаций дигитайзера. Установите фильтр нижних частот на 100 герц. В качестве альтернативы, чтобы преобразовать установку патч-зажима, подключите держатель образца ex vivo ERG через головную ступень к дифференциальному усилителю, который должен быть подключен к головной ступени усилителя патч-зажима.
Используйте системное программное обеспечение patch clamp и дигитайзер для записи и хранения входных данных из ex vivo ERG. Задайте параметры, как показано выше. Подключите светодиоды с соответствующими длинами волн к микроскопу.
Для управления световыми раздражителями используйте светодиодный драйвер, управляемый аналоговыми выходами дигитайзера. Управляйте светодиодами с помощью записывающего программного обеспечения, которое позволит запускать световые стимулы. Затем откалибруйте светоотдачу светодиодов в положении сетчатки в держателе образца с помощью фотодиода.
При необходимости вставьте фильтры нейтральной плотности, чтобы приглушить интенсивность света в световом контуре. Чтобы подготовить электрод, вставьте гранулированный электрод из хлорида серебра в резьбовой разъем приманки. Заполните внутреннюю часть соединителя приманки горячим клеем и вставьте двухмиллиметровое гнездо в горячий клей с нерезной стороны.
Припаяйте серебряную проволоку электрода EP-1 к двухмиллиметровому разъему. Вкрутите готовый электрод с уплотнительным кольцом на резьбе в электродные порты держателя образца ex vivo ERG. Для больших глаз, в том числе человеческих донорских глаз, очистите шар от оставшейся соединительной ткани и удалите передний сегмент и хрусталик.
Используйте скальпель, чтобы сделать разрез примерно в трех миллиметрах от лимбуса. Вставьте изогнутые ножницы для рассечения в разрез и разрезайте вдоль лимбуса, чтобы удалить переднюю часть глаза с помощью хрусталика. Получение образцов сетчатки для электроретинографии ex vivo с трех-шестимиллиметровым одноразовым биопсийным перфоратором.
Чтобы закрепить ткань на держателе образца, поместите нижнюю половину держателя образца в большую чашку Петри и заполните ее насыщенной кислородом средой Эймса таким образом, чтобы купол держателя образца был просто погружен. Осторожно захватите край сетчатки тонкими щипцами и перенесите сетчатку на купол держателя образца ex vivo, стороной фоторецептора лицом вверх. Поднимите держатель образца из раствора Эймса, заботясь о том, чтобы сетчатка оставалась на месте.
Полностью высушите пластину держателя образца, чтобы свести к минимуму шум, электрические перекрестные помехи и маневрирование сигнала. Затем соберите обе половины держателя образца четырьмя винтами и соедините перфузионную линию. Введите электрод в нижнюю половину держателя образца и подключите анодный кабель к внутренней стороне сетчатки, а катодный кабель со стороны фоторецептора.
Перфьюируйте держатель образца по меньшей мере одним миллилитром в минуту насыщенной кислородом среды Эймса в течение 10-20 минут, чтобы световые реакции стабилизировались. Ex vivo ERG позволил регистрировать световые реакции фоторецепторов и ON-биполярных клеток от сетчатки мыши. Запись реакций фоторецепторов от донорской сетчатки человека была возможна с посмертной задержкой энуклеации до пяти часов и задержкой менее 20 минут для реакций ON-биполярных клеток.
В идеальных условиях амплитуды ответа и кинетика в обоих типах клеток были относительно стабильными с течением времени, но показали медленное снижение через 40-45 минут после того, как сетчатка была установлена на держателе образца. Снижение температуры в держателе образца значительно замедлило кинетику как фоторецепторов, так и ON-биполярных клеток. Однако он уменьшил амплитуду волны B, но не волны A.
И наоборот, замедление скорости перфузии уменьшало амплитуды как фоторецепторов, так и реакций ON-биполярных клеток, но не влияло на неявное время волны А или В. Прекращение перфузии в течение 10 минут с последующей реперфузией приводило к полной потере функции ON-биполярных клеток с сохраненными реакциями фоторецепторов. Достаточная скорость перфузии и физиологическая температура имеют решающее значение для получения стабильных реакций, в частности, от ON-биполярных клеток в EX VIVO ERG.
Этот протокол позволяет углубленно исследовать различия в функции фоторецепторов в макулярной и периферии человека, отвечая на вопросы, которые ранее могли быть выполнены только у нечеловеческих приматов.
