Одной из проблем в исследованиях сетчатки является изучение перекрестных помех между различными клетками, такими как нейроны сетчатки, глиальные клетки и сосудистые клетки. В частности, изоляция и культивирование нейронов сетчатки является сложной задачей. Мы считаем, что культивируемая эксплантация сетчатки может преодолеть это ограничение и предложить уникальную систему ex vivo, которая позволяет нам изучать перекрестные помехи между различными клетками сетчатки при хорошо контролируемых биохимических параметрах и независимо от сосудистой системы.
Кроме того, эксплант сетчатки является выдающимся инструментом скрининга для изучения новых фармакологических вмешательств при различных ретиноваскулярных и нейродегенеративных заболеваниях, таких как диабетическая ретинопатия, которая характеризуется повреждением сосудов и нейронов. Наша лаборатория изучает патофизиологические изменения, способствующие микрососудистой дисфункции сетчатки в течение многих лет. Использование широкого спектра моделей, включая модели in vivo и in vitro, позволило нам оптимизировать множество методов в нашей лаборатории.
Здесь мы описываем подробный протокол для эксплантов сетчатки, полученных от взрослой мыши дикого типа, которую можно держать в культуре в течение двух недель. Держите животных в помещении при постоянной температуре и контролируемой светом среде. Осмотрите каждое животное на предмет здоровья, достаточного количества пищи и воды.
Обязательно обеспечьте животных свежей пищей и чистой водой. Меняйте загрязненные клетки ежедневно или по мере необходимости для здоровья животных. Используют самцов черных 6 мышей старше 12 недель.
Усыпляйте животных в их домашней клетке путем вдыхания передозировки углекислого газа. После завершения процедуры подтвердите гибель животного соответствующим методом, таким как подтверждение остановки сердца и дыхания или наблюдение за фиксированными и расширенными зрачками животного. Следите за подтверждением смерти вторичным методом эвтаназии, таким как вывих шейки матки.
Применяйте давление на орбиту с помощью изогнутых щипцов, пока земной шар не выступит. Осторожно закройте щипцы в задней части глаза и поднимитесь непрерывным движением. Погрузите глазное яблоко в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую один миллилитр ледяного HBSS.
Переложите глазное яблоко в 1,5- или двухмиллилитровую трубку, содержащую полную среду. Теперь он готов к рассечению. Эта диаграмма иллюстрирует последовательные шаги, которые будут показаны для рассечения глазного яблока мыши для создания эксплантата сетчатки.
Окружной разрез делается вдоль лимбуса, чтобы открыть глазное яблоко. Роговица удаляется путем рассечения вдоль лимбального разреза. Затем хрусталик и стекловидное тело удаляются, оставляя пустую глазную чашку.
Удерживая область головки зрительного нерва тонкими щипцами, аккуратно проводится отслаивание наружного слоя глаза. Большое внимание во время удаления наружной оболочки для того, чтобы не травмировать нервную сетчатку и иметь сетчатку полностью неповрежденной. Затем сетчатка будет разрезана на более мелкие кусочки.
Это будет большим преимуществом, потому что это позволит вам провести эксперимент, где ваша контрольная группа и экспериментальные группы получены из одного и того же животного. Тем не менее, разрезание сетчатки на мелкие кусочки сделает обработку ее более сложной. Поэтому мы разработали технику обработки этих небольших кусочков сетчатки, чтобы обеспечить правильную ориентацию культуры сетчатки.
Идите с рассекающим ножничным лезвием, открытым прямо под куском сетчатки. Медленно поднимите кусок сетчатки кончиком открытого ножничного лезвия и аккуратно перенесите его на культуральную пластину. Экспланты будут отдельно перенесены на вставки клеточной культуры в многолуночных пластинах, каждая из которых содержит 300 микролитров экстраплантной среды сетчатки лицом вверх.
Эксплантные культуры сетчатки будут поддерживаться в увлажненных инкубаторах при температуре 37 градусов цельсия и 5% углекислого газа. Убедитесь, что поверхность сетчатки обращена вверх. Если часть сетчатки перевернута или сложена, попробуйте аккуратно отрегулировать ее в нужной ориентации.
Неспособность поместить эксплант сетчатки в правильную ориентацию с нервной сетчаткой, обращенной вверх, приведет к нарушению правильного роста клеток сетчатки в культуре. Здесь мы можем видеть иммунофлуоресцентное окрашивание эксплантов сетчатки, окрашенных в культуру в течение двух недель. Экспланты были зафиксированы и окрашены NeuN для нейронов сетчатки, GFAP для глиальных клеток и лектином для кровеносных сосудов.
Окрашивание показало хорошо развитые клетки сетчатки и сосуды сетчатки. Здесь мы можем увидеть иммунофлуоресцентное окрашивание эксплантов сетчатки, фиксированных и окрашенных GFAP для глиальных клеток и лектином для кровеносных сосудов. Изображения показывают дефектное окрашивание и недоразвитие как клеток сетчатки, так и сосудов сетчатки.
Это связано с тем, что эксплант сетчатки был сложен и неправильно ориентирован на культуральную пластину. Большое внимание следует уделить правильной ориентации экспланта с сетчаткой лицом вверх. Наличие контрольной группы, полученной из того же одного животного, что и обработанная группа, делает большим преимуществом более надежное сравнение различных экспериментальных условий.
Имплантаты сетчатки могут обеспечить достойную платформу для исследования возможных терапевтических целей для широкого спектра заболеваний сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия и дегенеративные заболевания сетчатки.
