Общей целью этой процедуры является демонстрация методов рассечения для взрослой ноги дрозофилы. Этот метод удаляет часть кутикулы, обнажая подлежащую ткань таким образом, чтобы сохранить нейронную и мышечную архитектуру. Данная процедура позволяет охарактеризовать нервно-мышечное соединение для идентифицированных моторных нейронных беседок, используя стандартные иммуноцитарные химические методы.
Рассечение особенно полезно для изучения медленных дегенеративных изменений, которые происходят в течение относительно длительных периодов времени. Временной аспект является важным фактором, потому что хорошо охарактеризованное нервно-мышечное соединение личинок Drosophila стабильно в течение примерно пяти-семи дней до начала метаморфоза. И наоборот, взрослые нейроны присутствуют на протяжении всей жизни взрослой мухи, примерно 90 дней для дикого типа, выращенной в лаборатории Drosophila melanogaster.
Метод является гибким и может быть применен к ряду генотипов для различных моделей заболеваний и использовать ряд антител, доступных для дрозофилы, в качестве модельной системы. Общей целью этой процедуры является демонстрация методов рассечения для взрослой ноги дрозофилы. Этот метод удаляет часть кутикулы, обнажая подлежащую ткань таким образом, чтобы сохранить нейронную и мышечную архитектуру.
С помощью кисти переложите мух на холодный метанол в стеклянном колодце или посуде примерно от 30 секунд до одной минуты. Метанол солюбилизирует кутикулярные углеводороды, и мухи теперь могут погружаться, а не плавать в водных растворах. С помощью щипцов осторожно переведите мух на PBS.
Промыть три раза в ледяном холоде PBS, чтобы удалить избыток метанола, и держать мух в PBS на льду до рассечения и фиксации. В этот момент мухи должны быть рассечены и зафиксированы в течение как можно более короткого времени, предпочтительно менее 30 минут. Переложите мух на силиконовую эластомерную диссекционную посуду, наполненную холодным PBS.
Удалите метаторакальные ножки у кокса с помощью двух пар щипцов Дюмона номер пять или отрежьте ноги ножницами Vannas. Переложите ножки в колодец в пластиковой, 24 колодезной пластине, заполненной одним мил PBS, и держите пластину на льду, пока все ножки не будут удалены и перенесены в колодцы. Обычно мы используем 20 ножек на колодец.
Замените раствор PBS одним миллилитровым раствором FA и поверните на нутаторе в течение 30 минут. Настройка нутатора должна быть установлена на средней скорости. Убедитесь, что ноги полностью погружены в раствор в течение этого времени.
Чтобы удалить раствор FA, промыть в одном мил PBS три раза быстро, а затем еще три промывки в течение пяти минут каждая в одном mil PBS. Держите ткани в одном мил PBS на льду, до и во время этапов рассечения. Чтобы обеспечить краткий обзор анатомии ног дрозофилы, показаны сегменты ног, включая коксу, трохантер, бедренную кость, большеберцовую кость и пять предплюсневых сегментов.
Здесь мы видим передний вид ноги, распознаваемый по наличию сенсорных щетинок, в отличие от обнаженной кутикулы, присутствующей на задней стороне. Также указывается ориентация проксимально-дистальной оси и дорсально-вентральной оси. Эта процедура рассечения удаляет небольшой кусочек кутикулы из проксимальной бедренной кости, так что можно изучить беседки аксона, которые проецируются дорсально, иннервируя леваторную мышцу большеберцовой кости.
Наша предыдущая работа была сосредоточена на указанной беседке, происходящей из предполагаемой линии глаз нейробластов. В этой части процедуры мы удаляем кутикулу с передней стороны бедренной кости. Рассекающие щипцы имеют решающее значение для успеха, и мы обнаружили, что введение небольшого изгиба в конце числа пять сверхтонких щипцов обеспечивает скос, который позволяет захватывать кутикулу поверхностно, а не тыкать, что может испортить ткань.
Переложите ножки на силиконовую эластомерную посуду в PBS для рассечения. Используя одну пару щипцов, прикрепите сегмент большеберцовой кости к силиконовой эластомерной посуде, как показано здесь с правой стороны. Используя другие щипцы, удерживаемые скосом стороной вниз, захватите кусок кутикулы на дистальном конце бедренной кости и потяните в проксимальном направлении к трохантеру.
Продолжайте методично удалять кутикулу до тех пор, пока обнаженная мышца не будет видна по всему проксимальному концу бедренной кости. После того, как все ножки будут рассечены, замените PBS раствором FA на постфикс ноги в течение 30 минут с встряхиванием на нутаторе на средней скорости. После этого промывайте образцы в одном мил PBS в течение трех раз быстро, а затем три раза в течение пяти минут каждый в растворе PBT.
Чтобы блокировать ткани, замените один мил ПБТ блокирующим раствором, состоящим из одной мил 5% нормальной козьей сыворотки, разведенной в ПБТ. Инкубировать рассеченные ноги в течение четырех часов при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах Цельсия. Удалить блокирующий раствор и заменить первичным антителом, которое разводят в блокирующем растворе.
Здесь мы используем антидиски большого размера при разбавлении от одного до 200. Положите тарелки обратно на шейкер и высиживайте при четырех градусах в течение ночи. После первичной инкубации антител промывайте первичные антитела в одном мил ПБТ три раза ненадолго, а затем три раза в течение 15 минут каждое.
Снова блокируют ткани в одной мельнице 5%-ной нормальной козьей сыворотки в течение не менее двух часов при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах Цельсия. Удалить блокирующий раствор и добавить 300 микролитров соответствующих разбавленных флуоресцентных конъюгированных вторичных антител. Кроме того, добавьте одно к 2000 разведению флуоресцентного конъюгированного фаллоидина для маркировки мышц.
Для инкубации запечатайте колодцы лабораторной уплотнительной лентой и крышкой. Также оберните пластины в алюминиевую фольгу для защиты флуорофоров от света. Инкубировать в течение шести-восьми часов при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах Цельсия.
Чтобы удалить несвязанные вторичные антитела, выполняйте промывки ПБТ аналогичным образом, описанным ранее при промывке первичных антител. После этого шага образцы готовы к подключению и созданию образа. Расположите ножки передней стороной вверх и при необходимости накройте их дополнительными монтажными носителями.
Аккуратно соскребите углы крышки, скользящей по глиняному шару. Полученная глина будет служить распоркой между горкой и скольжением крышки, чтобы ткани не измельчались. Нажимайте на крышку до тех пор, пока она не коснется верхней части ног.
Запечатайте края лаком для ногтей и храните при четырех градусах до получения изображения. Изображение методом конфокальной микроскопии с использованием параметров визуализации описано в четвертом разделе письменного протокола. Чтобы помочь проверить протокол рассечения, мы сначала изобразим ноги с помощью фазовой контрастной микроскопии при низком увеличении.
Вот пример на панели А хорошего рассечения слева и плохого рассечения справа, при котором были нарушены мышечные волокна. Панель C показывает конфокальное изображение хорошего рассечения, при котором мышцы не были нарушены. Напротив, панель D показывает ногу, поврежденную во время рассечения, в которой отсутствуют мышечные волокна, как указано стрелкой.
Здесь мы окрасили изображенные ноги пероксидазой против хрена для обнаружения нейронных процессов, показанных здесь зеленым цветом, больших антидисков, что облегчает кластеризацию рецепторов постсинаптического глутамата, показанного красным цветом, и фаллоидин для маркировки мышц, показанных синим цветом. При съемке при 20-кратном увеличении с помощью проходящего светового канала легко увидеть рассеченную область. Обратите внимание, что антитела частично проникают в недиссектированные области, и их можно увидеть через кутикулу, как указано белой стрелкой.
Каждый из двигательных нейронов ноги делает стереотипные проекции при иннервации мышц. Наша работа сосредоточена на двигательных нейронах, иннервирующих большеберцовую леваторную мышцу, показанную здесь как коробчатую область и обозначенную белой стрелкой. При более высоком увеличении 60X с 2-кратным зумом в правом верхнем углу мы можем эффективно отображать бутоны, показанные зеленым цветом, и окружающий DLG, показанный красным.
Дальнейшее увеличение масштаба или приближение к цели 100X позволяет количественно оценить размер бутона и морфологию, как показано в правом нижнем углу. Используя эту технику рассечения в сочетании с иммуноцитохимией, мы обнаружили, что в мутантной модели БАС, показанной здесь в возрастных ногах H71Y, по сравнению с контрольной группой дикого типа, как указано стрелками, существует Н-зависимый отек бутона. Размеры бутонов количественно определяются на участке пчелиного роя справа.
Мы также обнаружили снижение маркера активной зоны Bruchpilot, показанного красным цветом, в слабо окрашенных аксонах HRP, показанных зеленым цветом, мутантов H71Y. Для изучения нейродегенерации убиквитинированные белковые агрегаты часто обнаруживаются антителом FK2 и показаны здесь как FK2-положительные пункты, в аксонах и мышцах стареющих дерновых мух H71 с правой стороны, обозначенных стрелками. Наконец, митохондрии могут быть визуализированы иммуноцитохимией с использованием моноклонального антитела против АТФ5а, как показано здесь красным цветом в леваторной мышце большеберцовой кости.
Мы обнаружили, что митохондрии увеличиваются с возрастом у мутантов H71Y. После освоения препарат рассеченной ноги и связанное с ним окрашивание антител позволят вам анализировать молекулярные изменения во взрослом нервно-мышечном соединении для вашего любимого мутанта в различные моменты времени.
