Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Dissektionsmethoden für das erwachsene Bein von Drosophila zu demonstrieren. Diese Technik entfernt einen Teil der Nagelhaut und legt das darunter liegende Gewebe auf eine Weise frei, die die neuronale und muskuläre Architektur bewahrt. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, die neuromuskuläre Verbindung für identifizierte Motoneuronlauben unter Verwendung von immunzytären chemischen Standardtechniken zu charakterisieren.
Die Dissektion ist besonders nützlich für die Untersuchung langsamer degenerativer Veränderungen, die über relativ lange Zeiträume auftreten. Der Zeitaspekt ist eine wichtige Überlegung, da die gut charakterisierte neuromuskuläre Verbindung von Drosophila-Larven etwa fünf bis sieben Tage vor Beginn der Metamorphose stabil ist. Umgekehrt sind die erwachsenen Neuronen während des gesamten Lebens einer erwachsenen Fliege vorhanden, etwa 90 Tage für einen wildtypischen, im Labor aufgezogenen Drosophila melanogaster.
Die Technik ist flexibel und kann auf eine Reihe von Genotypen für verschiedene Krankheitsmodelle angewendet werden und eine Reihe von Antikörpern verwenden, die für Drosophila als Modellsystem verfügbar sind. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Dissektionsmethoden für das erwachsene Bein von Drosophila zu demonstrieren. Diese Technik entfernt einen Teil der Nagelhaut und legt das darunter liegende Gewebe so frei, dass die neuronale und muskuläre Architektur erhalten bleibt.
Mit einem Pinsel Fliegen in einem Glastopf oder einer Schale für etwa 30 Sekunden bis zu einer Minute in kaltes Methanol überführen. Das Methanol löst die kutikulären Kohlenwasserstoffe, und Fliegen können jetzt in wässrigen Lösungen eingetaucht werden, anstatt zu schwimmen. Mit einer Pinzette fliegen vorsichtig auf PBS übertragen.
Spülen Sie dreimal in eiskaltem PBS, um überschüssiges Methanol zu entfernen, und halten Sie fliegen in PBS auf Eis bis zur Dissektion und Fixierung. An dieser Stelle sollten Fliegen innerhalb kürzester Zeit, vorzugsweise weniger als 30 Minuten, seziert und fixiert werden. Fliegen in eine silikonelastische Dissektionsschale geben, die mit kaltem PBS gefüllt ist.
Entfernen Sie die metathorakalen Beine an der Coxa mit zwei Paaren der Dumont-Pinzette Nummer fünf oder schneiden Sie die Beine mit einer Vannas-Schere ab. Übertragen Sie die Beine in einen Brunnen in einem Kunststoff, 24 Well Platte gefüllt mit einer Mil PBS, und halten Sie die Platte auf Eis, bis alle Beine entfernt und in Brunnen übertragen werden. Wir verwenden normalerweise 20 Beine pro Brunnen.
Ersetzen Sie die PBS-Lösung durch eine Milliliter FA-Lösung und drehen Sie sie 30 Minuten lang auf einem Nutator. Die Nutatoreinstellung ist auf eine mittlere Drehzahl einzustellen. Stellen Sie sicher, dass die Beine während dieser Zeit vollständig in die Lösung eingetaucht sind.
Um FA-Lösung zu entfernen, waschen Sie in einem mil PBS dreimal schnell, gefolgt von weiteren drei Wäschen für jeweils fünf Minuten in einem mil PBS. Halten Sie Gewebe in einer Mil PBS auf Eis, vor und während der Dissektionsschritte. Um einen kurzen Überblick über die Anatomie der Drosophila-Beine zu geben, sind die Beinsegmente angegeben, einschließlich der Coxa, des Trochanters, des Femurs, der Tibia und der fünf Tarsalsegmente.
Hier sehen wir eine vordere Ansicht des Beines, erkennbar an der Anwesenheit von sensorischen Borsten im Gegensatz zu nackter Kutikula auf der hinteren Seite. Die Ausrichtung der proximal-distalen Achse und der dorsal-ventralen Achse sind ebenfalls angegeben. Dieses Dissektionsverfahren entfernt ein kleines Stück Kutikula aus dem proximalen Femur, so dass Axonlauben, die dorsal herausragen und den Musculus tibia levator innervieren, untersucht werden können.
Unsere bisherige Arbeit konzentrierte sich auf die indizierte Laube, die aus der präsumtiven Neuroblasten-Augenlinie stammt. In diesem Teil des Verfahrens entfernen wir die Nagelhaut von der vorderen Seite des Femurs. Die Sezierzange ist entscheidend für den Erfolg, und wir haben festgestellt, dass die Einführung einer leichten Biegung am Ende der superfeinen Pinzette Nummer fünf eine Fase bietet, die es ermöglicht, die Nagelhaut oberflächlich zu greifen, anstatt gestochen zu werden, was das Gewebe ruinieren kann.
Die Beine zur Dissektion in eine Silikonelastomerschale in PBS überführen. Befestigen Sie das Tibiasegment mit einer Pinzette an der Silikonelastomerschale, wie hier auf der rechten Seite gezeigt. Greifen Sie mit der anderen Pinzette, die mit der Schräge nach unten gehalten wird, ein Stück Nagelhaut am distalen Ende des Femurs und ziehen Sie in die proximale Richtung zum Trochanter.
Entfernen Sie die Nagelhaut methodisch, bis der nackte Muskel am proximalen Ende des Femurs sichtbar ist. Sobald alle Beine seziert sind, ersetzen Sie PBS durch FA-Lösung, um die Beine für 30 Minuten mit Schütteln auf einem Nutator bei mittlerer Geschwindigkeit zu postfixieren. Anschließend werden die Proben in einem mil PBS dreimal schnell und dann dreimal für jeweils fünf Minuten in PBT-Lösung gewaschen.
Um Gewebe zu blockieren, ersetzen Sie ein mil PBT durch eine Blockierenlösung, die aus einem mil 5% normalem Ziegenserum besteht, das in PBT verdünnt ist. Inkubieren Sie sezierte Beine für vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie die blockierende Lösung und ersetzen Sie sie durch einen primären Antikörper, der in blockierender Lösung verdünnt wird.
Hier verwenden wir Anti-Discs groß bei einer bis 200 Verdünnung. Teller wieder auf einen Shaker legen und über Nacht bei vier Grad inkubieren. Nach der primären Antikörperinkubation werden die primären Antikörper dreimal kurz in einem mil PBT und dann dreimal für jeweils 15 Minuten gewaschen.
Blockieren Sie Gewebe wieder in einer Mühle 5% normales Ziegenserum für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie die Blockierende Lösung und fügen Sie 300 Mikroliter der entsprechenden verdünnten fluoreszierenden konjugierten sekundären Antikörper hinzu. Zusätzlich fügen Sie eine bis 2000 Verdünnung von fluoreszenzkonjugiertem Phalloidin hinzu, um den Muskel zu markieren.
Um zu inkubieren, versiegeln Sie die Vertiefungen mit Laborsiegelband und Deckel. Wickeln Sie die Platten auch in Aluminiumfolie, um Fluorophore vor Licht zu schützen. Sechs bis acht Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.
Um ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen, führen Sie Waschungen mit PBT in einer ähnlichen Weise durch, die zuvor beim Waschen des primären Antikörpers beschrieben wurde. Nach diesem Schritt können die Samples nun gemountet und abgebildet werden. Ordnen Sie die Beine mit der vorderen Seite nach oben an und bedecken Sie sie bei Bedarf mit zusätzlichen Montagemedien.
Kratzen Sie vorsichtig die Ecken eines Deckels über eine Tonkugel. Der resultierende Ton dient als Abstandshalter zwischen dem Objektträger und dem Deckslip, so dass das Gewebe nicht zerquetscht wird. Drücken Sie auf den Abdeckzettel, bis er die Oberseite der Beine berührt.
Verschließen Sie die Kanten mit Nagellack und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei vier Grad. Bild durch konfokale Mikroskopie unter Verwendung von Bildgebungsparametern, die in Abschnitt vier des schriftlichen Protokolls beschrieben sind. Um das Dissektionsprotokoll zu validieren, bilden wir zunächst Beine durch Phasenkontrastmikroskopie bei geringer Vergrößerung ab.
Hier ist ein Beispiel auf Panel A für eine gute Dissektion auf der linken Seite und eine schlechte Dissektion auf der rechten Seite, bei der Muskelfasern gestört wurden. Panel C zeigt ein konfokales Bild einer guten Sezierung, bei der der Muskel nicht gestört wurde. Im Gegensatz dazu zeigt Panel D ein während der Dissektion geschädigtes Bein, bei dem Muskelfasern fehlen, wie der Pfeil anzeigt.
Hier haben wir ein abgebildetes Bein mit Anti-Meerrettichperoxidase gefärbt, um neuronale Prozesse zu erkennen, hier in grün, Anti-Scheiben groß, was die postynaptische Glutamatrezeptor-Clusterung erleichtert, rot dargestellt, und Phalloidin, um den Muskel zu markieren, blau dargestellt. Bei einer Aufnahme mit 20-facher Vergrößerung mit einem durchgelassenen Lichtkanal ist es leicht, den sezierten Bereich zu sehen. Beachten Sie, dass Antikörper teilweise in unbestimmte Bereiche eindringen und durch die Kutikula gesehen werden können, wie durch den weißen Pfeil angezeigt.
Jedes der Bein-Motoneuronen macht stereotype Projektionen, wenn es Muskeln innerviert. Unsere Arbeit konzentriert sich auf Motoneuronen, die den Musculus tibia levator innervieren, der hier als geboxte Region dargestellt und durch den weißen Pfeil angezeigt wird. Bei einer höheren Vergrößerung von 60X mit 2-fachem Zoom oben rechts können wir Boutons, die in Grün dargestellt sind, und die umgebende DLG, die in Rot dargestellt sind, effektiv abbilden.
Das Weitere Vergrößern des Zooms oder das Stufen zu einem 100-fachen Objektiv ermöglicht die Quantifizierung der Boutongröße und -morphologie, wie unten rechts gezeigt. Mit dieser Dissektionstechnik in Kombination mit Immunzytochemie fanden wir heraus, dass es in einem Sod1-Mutantenmodell von ALS, das hier in gealterten H71Y-Beinen gezeigt wird, im Vergleich zu Wildtypkontrollen, wie durch die Pfeile angezeigt, eine H-abhängige Boutonschwellung gibt. Boutongrößen werden im Bienenschwarmdiagramm rechts quantifiziert.
Wir fanden ferner eine Reduktion des aktiven Zonenmarkers Bruchpilot, rot dargestellt, in schwach gefärbten HRP-Axonen, grün dargestellt, von H71Y-Mutanten. Um die Neurodegeneration zu untersuchen, werden ubiquitinierte Proteinaggregate häufig durch den Antikörper FK2 nachgewiesen und hier als FK2-positive Puncta in den Axonen und Muskeln von gealterten Sod-H71-Fliegen auf der rechten Seite gezeigt, die durch die Pfeile angezeigt werden. Schließlich können Mitochondrien durch Immunzytochemie unter Verwendung eines monoklonalen Anti-ATP5a-Antikörpers visualisiert werden, wie hier rot im Musculus tibia levator gezeigt.
Wir fanden heraus, dass Mitochondrien bei H71Y-Mutanten mit zunehmendem Alter vergrößert werden. Einmal gemeistert, ermöglicht Ihnen die sezierte Beinvorbereitung und die damit verbundene Antikörperfärbung, molekulare Veränderungen an der adulten neuromuskulären Verbindung für Ihre bevorzugte Mutante zu verschiedenen Zeitpunkten zu analysieren.
