Этот метод может быть легко адаптирован для наблюдения сигналов от других флуоресцентных белков или может быть использован для изображения аксонов у других взрослых Основное преимущество этой техники облегчает отличную трехмерную реконструкцию и визуализацию аксонов и их терминальных беседок. Начните с заполнения соответствующего количества скважин в стеклянной пластине с 70% этанола. Используйте кисть, чтобы добавить от 15 до 20 углекислого газа анестезии мух любого возраста или пола, чтобы каждый хорошо и осторожно мазок мух в этанол, пока они полностью погружены.
После не более чем одной минуты, промыть мух в три раза с 0,3%non-ionic сурфактант моющего средства раствора в фосфат-буферный солевой раствор, по крайней мере 10 минут за стирку. После последней стирки используйте типсы, чтобы удалить голову и живот каждой мухи, не повреждая грудной сегмент или ноги, и используйте кончик пары тонких типсов, чтобы мягко, но твердо оказать давление на кокса-грудную клетку, чтобы отделить одну ногу от грудного сегмента. Поместите ноги в один колодец новой пластины из нескольких хорошо, содержащей свежеприготовленные 4%paraformaldehyde на льду для ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию.
Важно, чтобы подтолкнуть ноги мягко в буфер фиксации, не давая им плавать, чтобы получить хорошо закрепленные ноги. На следующий день, мыть ноги пять раз в свежем 0,3%non-ionic surfactant моющее средство решение в течение 20 минут за стирку. После последнего мытья, заменить моющее средство с монтажом среды и держать ноги в монтажной среде, по крайней мере 24 часов.
На следующий день добавьте около 20 микролитров 70%глицерола рядом с покрытым концом слайда стеклянного микроскопа и накройте глицерол 22 на 22 миллиметра крышкой. Затем добавьте около 10 микролитров линии монтажной среды справа от крышки и нанесите вторую 30-микролитровую линию монтажной среды справа от линии 10 микролитров. Используя тонкие типсы, перенесите одну ногу из пластины с мульти-хорошо в капле среднего до 10 микролитровой полосы монтажной среды во внешней стороне вверх или вниз ориентации.
Повторите до тех пор, пока шесть-восемь ног были установлены и выровнены и место второй coverslip над ногами так, что второй coverslip лежит немного на первом coverslip. Затем используйте лак для ногтей в каждом углу крышки, чтобы обеспечить их на месте. Для изображения ног, используйте 488 нанометровый лазер и два детектора одновременно, чтобы создать первый трек для получения как GFP и кутикулы автоматической флуоресценции.
Выберите цель погружения масла от 20 до 25X и установите разрешение до 1024 на 1024 пикселей с 12-битной глубиной и установите интервал z до одного микрометра. Загрузите слайд на сцену микроскопа и используя одинаковую лазерную мощность для обоих детекторов, отрегулируйте усиление первого детектора, чтобы получить яркий сигнал GFP, и отрегулируйте второй детектор, чтобы убедиться, что некоторые области с высоким сигналом кутикулы производят насыщенный сигнал в этом детекторе. Затем изображение ноги с помощью плитки или позиции вариантов для захвата всей ноги, если нога расширена или слишком велика, чтобы быть изображены в одном кадре.
Для обработки изображений откройте конфокальный стек в ImageJ Fiji и используйте плагин Bio-Formats, чтобы открыть любые изображения, которые не находятся в формате TIFF. Чтобы разделить каналы, выберите каналы Изображения, Цвета и Сплита. Чтобы вычесть сигнал кутикулы из сигнала GFP, откройте калькулятор процесса и изображения и выберите стек из детектора один в качестве изображения.
В окне операции выберите вычесть и выбрать трек из детектора два, как изображение два, так что только эндогенный сигнал GFP будет получен. Используйте изображение, стеки, защиту для генерации максимальной интенсивности проекции для эндогенного сигнала GFP. Используйте элементы управления в окне управления яркостью для регулировки яркости и контрастности.
Затем создайте среднюю интенсивность кутикулы, а затем Каналы изображения, цвета и слияния, чтобы объединить стек GFP обратно с стеком только для кутикулы, приобретенным у детектора два. Это приведет к RGB изображение состоит из ткани конкретных GFP сигнала, а также кутикулы сигнал, чтобы помочь определить аксон беседки в ногах сегментов. Чтобы использовать макрос, откройте конфокальный стек и нажмите изображение, отрегулируйте и яркость/контрастность.
Затем нажмите Plugin и Macro Run, чтобы запустить макрос и следуйте инструкциям. При просьбе указать операцию в окне калькулятора изображений выберите изображение в качестве стека. В окне операции выберите вычитание.
Выберите изображение два в качестве стека два. Когда вас просят настроить контрастность, используйте элементы управления в окне управления яркостью, чтобы настроить контрастность яркости максимального проекционного изображения GFP и средней проекции кутикулы для создания RGB объединенного изображения обоих сигналов, показывающих GFP зеленым цветом, и кутикулы серым цветом. Затем объединить результаты стека один и стек два для создания комбинированного GFP и кутикулы стек, который может быть использован на следующем этапе.
Чтобы визуализировать ноги в трех измерениях, откройте стек RGB в соответствующей 3D-программе. В окне всплывающего диалога выберите все каналы в разделе преобразования режима и введите размер воксела, полученного из предыдущего анализа. В модуле первого канала нажмите правой кнопкой мыши и выберите Дисплей и Volren.
Затем слева нажмите на модуль Volren. В разделе Свойства слева нажмите на Расширенный и выберите DDR. Затем отрегулируйте гамма-значение, чтобы увидеть фон кутикулы.
В модуле канала два, право нажмите и выберите дисплей Volren. Затем слева нажмите на модуль Volren, редактировать и выберите volrenGreen.col. Используя эту процедуру, сигнал от кутикулы может быть объединен с сигналом GFP для определения позиционирования аксонов в ногах.
Критически важно получить хорошо закрепленные ноги. В правильно закрепленных ногах, внутренние структуры внутри ног имеют равномерный цвет и трахеи, которые темные, видны. В плохо закрепленных ногах, темный материал присутствует в tarsus и голени и трахеальной системы не ясно видны в бедренной кости и кокса.
Процедура, которую мы описали здесь, преодолевает проблему обнаружения флуоресцентного экспрессии в аксонах моторных нейронов через толстую и автоматическую флуоресцентную кутикулу с высоким разрешением. Таким образом, полученный чистый и подробный флуоресцентный сигнал позволяет нам визуализировать и количественно визуализировать трехмерную особенность аксонов с помощью 3D-программ визуализации. Таким образом, этот метод позволит нам использовать взрослую дрозофилу в качестве модели не только для изучения развития моторного нейрона, но и для изучения, чтобы понять влияние дегенеративных заболеваний, таких как ERAS на локомотивную систему интегрированы.
