Этот протокол описывает простой и быстрый метод измерения митохондриальной функции опухоли. Протокол широко применим к клинической трансляционной онкологии и поможет улучшить диагностическую и механистическую интерпретацию роли митохондрий в возникновении и прогрессировании рака. Основным преимуществом этой методики является применение гомогенизации тканей для упрощения приготовления и максимизации выхода митохондрий при одновременном смягчении ограничений диффузии.
Этот метод предлагает потенциальное применение в клинических и диагностических условиях с количественной оценкой функции митохондрий опухоли с использованием свежепанзионной или иссеченной опухолевой ткани. Начните с помещения стеклянного гомогенизатора, содержащего один миллилитр митохондриальной дыхательной среды, или MiR05, в плотно прилегающий стеклянный пестик на влажном льду. Поместите ткань в один миллилитр раствора для сохранения биопсии, или BIOPS, в ледяную чашку Петри.
Разрежьте опухоль на небольшие кусочки примерно по 5-10 миллиграммов каждый, а оставшиеся кусочки опухоли поместите обратно в 10 миллилитров BIOPS, хранящихся на льду. После тщательного промокания участков тканей на фильтровальной бумаге поместите их на небольшую пластиковую смоляную весовую лодку и запишите начальный влажный вес. Поместите неиспользованные кусочки обратно в 10-миллилитровую коническую трубку BIOPS для дальнейшего сохранения.
Погрузите участки ткани в гомогенизатор ледяного холода, содержащий MiR05, и запишите оставшийся вес на весовой лодке. Используя стеклянный пестик с диапазоном клиренса от 0,09 до 0,16 миллиметра, мягко разрушайте опухолевую ткань, выполнив пять-семь ударов вниз и вверх. Для каждого удара поворачивайте пестик по часовой стрелке / против часовой стрелки три раза, толкая пестик вниз, и три дополнительных раза, вытягивая пестик обратно вверх.
Дайте ткани осесть на дно гомогенизатора между ударами, но избегайте полного поднятия пестика над объемом жидкости, чтобы предотвратить вспенивание. Вылейте гомогенат в 15-миллилитровую коническую трубку и поместите его на лед. Пипетка от одного до трех миллилитров свежего MiR05 над пестиком и в гомогенизатор для промывки оставшегося гомогената ткани.
Вылейте промывку MiR05 в коническую трубку, содержащую гомогенат. Повторите этот шаг два-три раза, чтобы обеспечить полную передачу гомогената. Чтобы точно рассчитать концентрацию гомогената в тканях, тщательно осмотрите гомогенизатор и гомогенат на наличие оставшегося негомогенизированного материала, в состав которого входит соединительная ткань.
Чтобы удалить из гомогенизатора негомогенизированный материал, который не может быть достигнут пинцетом, после добавления MiR05 к гомогенизатору аспирировать объем, включая ткань, пипеткой и переместить содержимое в чашку Петри. Извлеките неомогенизированный материал, осевший крупными кусками в нижней части конической трубки, из гомогената, аспирируя их пипеткой, и поместите их на крышку конической трубки. Снимите ткань с чашки Петри или колпачка конической трубки пинцетом и промойте ее на фильтровальной бумаге.
Добавьте оставшийся гомогенат из колпачка конической трубки обратно в коническую трубку. Закройте трубку крышкой, затем переверните, чтобы перемешать. Повторно проверьте гомогенизаторы и гомогенат для любого дополнительного негомогенизированного материала и повторите шаги, чтобы удалить негомогенизированный материал, если это необходимо.
Взвешивайте и регистрируйте массу неодногенизированного материала, извлеченного из гомогенизатора. Осмотрите гомогенатный препарат на наличие любой переносимой грубо неповрежденной ткани, удалите неоднородизированные кусочки и взвесьте по мере необходимости. Вычтите вес ткани, извлеченный из весовой лодки, гомогенизатора и гомогената из первоначального живого веса, чтобы рассчитать окончательный вес образца.
Используя окончательную массу образца, добавьте дополнительный MiR05, чтобы довести гомогенат до желаемой концентрации. После того, как гомогенат взвешен и приготовлен, приступайте к анализу как можно скорее. Храните образец на влажном льду до тех пор, пока он не будет перенесен на инструмент.
После калибровки прибора и подготовки образца снимите пробки скручивающим движением и аспирируйте MiR05 из камер, избегая мембраны, подвергающейся воздействию внутри камеры. Хорошо перемешайте гомогенат и добавьте в камеру 2,25 миллилитра гомогената. Предположим, что один гомогенат добавляется в несколько камер, пипетка по одному миллилитру гомогената за раз в каждую камеру, смешивая гомогенат для обеспечения равного распределения тканей.
Нажмите клавишу F4, чтобы назвать событие и пометить время, а затем нажмите кнопку ОК. Наполните 50-миллилитровый шприц кислородом из кислородного баллона с регулятором и газовой трубкой с помощью тупой иглы 18-го калибра. Вводите кислород непосредственно в камеры, чтобы гипероксигенировать их примерно до 500 микромолярного кислорода.
Свободно вставьте пробки и подождите, пока кислород не достигнет примерно 480-микромоляров. Скручивающим движением медленно закройте камеру и дайте дыханию уравновеситься в течение примерно 15-20 минут. При необходимости заполните центральный капилляр пробки MiR05.
Используйте специальные микрошприцы для введения подложек, разъединителей и ингибиторов в полностью закрытые камеры, чтобы назвать и отметить время событий для каждой камеры в режиме реального времени. Выберите F6, чтобы при необходимости отрегулировать концентрацию кислорода и отрицательные масштабы наклона кислорода. После каждой инъекции промывайте шприц три раза в воде для водорастворимых соединений и 70% этаноле для растворенных в этаноле соединений.
Добавьте пять микролитров 0,8-молярного малата и приступайте сразу к следующей инъекции. Промыть шприц для инъекций три раза в воде. Сразу же добавьте пять микролитров 1-молярного пирувата, и дождитесь стабилизации дыхания.
После промывки шприца добавьте 10 микролитров 0,5-молярного АДФ и дождитесь стабилизации реакции АДФ. Вымойте шприц и добавьте пять микролитров 2-молярного глутамата и дождитесь стабилизации дыхания. Вымойте шприц, затем добавьте пять микролитров 4-миллимолярного цитохрома-С и дождитесь стабилизации дыхания.
После промывки шприца добавить 20 микролитров 1-молярного сукцината и дождаться стабилизации дыхания. Титруйте 0,5-1-микролитровые приращения 1-миллимолярного FCCP и ждите, пока дыхание стабилизируется после каждой инъекции. Продолжают до тех пор, пока не произойдет дополнительного увеличения дыхания.
Промыть шприц для инъекций трижды в 70% этаноле. Добавьте два микролитра 150-микромолярного ротенона и дождитесь стабилизации дыхания. Добавьте еще один микролитр ротенона, чтобы убедиться, что нет дальнейшего ингибирования.
Если наблюдается снижение дыхания, продолжайте дополнительные инъекции до тех пор, пока не произойдет снижения дыхания, затем трижды промойте инъекционный шприц 70% этанолом. Добавьте два микролитра 125-микромолярного антимицина А и дождитесь стабилизации дыхания. Добавьте еще один микролитр антимицина А, чтобы убедиться, что нет дальнейшего ингибирования.
Если наблюдается снижение дыхания, продолжайте дополнительные инъекции до тех пор, пока не произойдет снижения дыхания. Трижды промыть шприц 70% этанолом. Проверьте концентрацию кислорода в камере.
Если концентрация ниже 125-микромолярной, реоксигенируйте в комнатный воздух или слегка гипероксигенат, чтобы гарантировать, что кислород не ограничивает дыхательный поток. Добавьте пять микролитров 0,8-молярного аскорбата. Промыть шприц три раза в 70% этаноле.
Сразу добавьте 10 микролитров 0,2-молярного TMPD, и дождитесь увеличения дыхания. После промывки шприца этанолом добавляют 25 микролитров 4-молярного азида натрия сразу же, когда дыхательный поток аскорбата TMPD плато. Завершите работу, щелкнув Файл, Сохранить и отключиться.
Было замечено, что 40 миллиграммов на миллилитр тканевого гомогената приводили к быстрому истощению кислорода. Потребление кислорода существенно замедлилось с 30 и 20 миллиграммами на миллилитр тканевого гомогената, но все же быстро снизилось за короткое время в отсутствие субстратов или АДФ. Концентрация гомогената тканей в 10 миллиграммах на миллилитр привела к оптимальному потреблению кислорода.
Протокол SUIT использовался для оценки NADH- и сукцинат-связанного окислительного фосфорилирования и переноса электронов, а также активности комплекса IV. Высвобождение цитохрома С оценивали в присутствии пирувата и малата или сукцината и ротенона, оба из которых показали, что гомогенатный препарат не повреждает митохондрии. Также было обнаружено, что NADH-связанное окислительное фосфорилирование было незначительным в опухолях EO771.
Титрование FCCP для управления максимальным потоком электронов показало, что в опухолях EO771 фосфорилирование, а не окисление, ограничивало дыхание. Гомогенатные респираторные профили опухоли были аналогичны профилям неимплантированных, пермеабилизированных дигитонином клеток EO771, за исключением уменьшенного максимального переноса электронов, поддерживаемого N- и S-сцепленными субстратами в опухоли. Респираторную кинетику сукцината дополнительно оценивали путем поэтапного титрования субсатурирующего АДФ до достижения максимальной скорости.
Полумаксимальная концентрация АДФ в присутствии сукцината и ротенона составляла 37,5-микромолярной, тогда как максимальная скорость составляла примерно 10,5 пикомолей в секунду на миллиграмм. Инструменты, установленные для рутинного ухода, а также обработки тканей, имеют решающее значение для успеха этих экспериментов. В соответствии с этими процедурами могут применяться другие массовые или маркерные подходы к нормализации ставок на основе вопроса о проценте.
Общие показатели включают общую количественную оценку белка и ферментативную активность цитратсинтазы, но варьируются в зависимости от системы моделей, статистического дизайна и исследовательского вопроса.
