Эти протоколы предназначены для моделирования эффектов in vitro дополнительного использования кислорода на микробиом легких пациентов с муковисцидозом. Этот рецепт среды предназначен для отражения физиологического состава мокроты для людей, живущих с муковисцидозом. Процесс разбрызгивания вводит возможность культивирования в различных кислородных условиях.
Изменения в искусственной среде мокроты позволяют ей имитировать другие хронические заболевания легких и моделировать микробные сообщества в других условиях, таких как различные концентрации глюкозы у пациентов с муковисцидозом и диабетом. Обзор этапов подготовки искусственной мокроты показывает смешивание подготовленных ASCM, ASMM и ASBM. Буфер швабр используется для титрования рН до 6,3, а фильтрационная стерилизация среды осуществляется в холодном помещении на орбитальном шейкере.
Для начала подготовьте искусственную среду мокроты, добавив 250 миллилитров ASCM в литровую бутылку, содержащую ASMM. Затем добавьте 250 миллилитров ASBM в среднюю бутылку. Титруйте среду основным буфером молярной швабры, чтобы достичь рН 6,3 на рН-бумаге.
Охладить искусственную среду мокроты при четырех градусах Цельсия до фильтрации. Затем, чтобы начать процесс фильтрации, перенесите 200 миллилитров нефильтрованной искусственной мокроты в вакуумную систему фильтрации с фильтром размером пор 0,22 микрометра. После подключения системы фильтрации к вакуумному насосу включите вакуумный насос, затем поместите камеру на орбитальный шейкер, встряхиваясь со скоростью 90 оборотов в минуту в холодном помещении при четырех градусах Цельсия.
Замените фильтр после того, как 350 миллилитров среды будет отфильтровано, чтобы преодолеть проблему засорения. После значительного количества фильтруется, на дополнительных 150 миллилитров среда для фильтрации. Повторите фильтрацию с помощью дополнительных камер до тех пор, пока все среды не будут отфильтрованы.
Обзор кислородного разбрызгивания, демонстрирующий добавление мокроты пациента к искусственной мокроте в аутоклавном сывороточном флаконе. Затем разрежьте герметичный баллон с сывороткой газовой смесью. Наконец, флакон сыворотки инкубируют для получения культуры Алека Уоттса с 24-часовым интервалом для последующего секвенирования метагеномики.
Чтобы начать разбрызгивание сывороточного флакона, маркируйте 500-миллилитровые автоклавные сывороточные флаконы с идентификаторами образцов, датой и временем инокуляции и целевым процентом кислорода. В биологическом капюшоне добавьте 24 миллилитра искусственной мокроты в каждый установленный флакон сыворотки. Для получения достаточного объема образца для каждого условия культуры при необходимости разбавляют образец стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором, затем гомогенизируют мокроту иглой 18 калибра и добавляют по одному миллилитру мокроты пациента в каждый флакон сыворотки.
Затем, используя стерильный пинцет, поместите автоклавные резиновые пробки на верхнюю часть каждой бутылки сыворотки, нажмите на резиновые пробки, не касаясь нижней стороны пробки. После извлечения бутылок из вытяжки нанесите и обжимайте алюминиевые уплотнения. Снимите центральную часть пломб и протрите верхнюю часть бутылок спиртовой салфеткой и пропустите пломбу бутылки через пламя горелки Бунзена.
Теперь прикрепите стерильную иглу 18 калибра к плунжерному шприцу с фильтром, сначала вставьте прикрепленный газоотводящий шприц в бутылку. Теперь закрепите стерильную иглу 18 калибра к выходу газа из системы и вставьте иглу выхода газа в баллон. Проложите Т-образные соединения из резервуаров через кислородный монитор.
После проверки целевой концентрации кислорода, протекающей через систему, ориентируйтесь примерно на пять литров в минуту потока газа. Перенаправьте Т-образные соединения из резервуаров на выход газа. Когда газ начнет течь через баллон со сывороткой, обратите пристальное внимание на манометр, и если давление неожиданно увеличивается, немедленно выключите систему.
После бега кислород проходит через бутылку сыворотки в течение одной минуты со скоростью пять литров в минуту, настройки допускают 10 воздухообменов и гарантируют, что внутренняя атмосфера достигнет нужной концентрации 100% кислорода. Удалите газоотвод, иглу 18 калибра. После того, как давление в бутылке сыворотки нарастает до одной атмосферы, немедленно удалите иглу на выходе газа.
Инкубируйте флаконы с сывороткой в шейкере инкубатора при температуре 37 градусов Цельсия со скоростью 150 оборотов в минуту с интервалом 3, 24 часа. Алек Уоттс берется с интервалом в 24 часа для последующего анализа, и образцы каждый раз пересаживаются. Приведенный здесь пример показывает, как может выглядеть культура до и после инкубации.
Уровни оттока кислорода и рН измерялись в ходе процесса культивирования образцов мокроты, поддерживаемых на уровне 37 градусов Цельсия. С интервалами разбрызгивания в 12 часов и 24 часа концентрации кислорода примерно поддерживались с течением времени с умеренным падением концентрации кислорода, наблюдаемым для всех трех условий. Измеренные уровни pH находились в физиологическом диапазоне без существенных изменений с течением времени.
Сравнение микробной нагрузки, разнообразия и состава сообществ между некультурной и культивируемой мокротой выявило 20-кратное увеличение микробной нагрузки в культивируемой мокроте. Показатели разнообразия указывали на сохранение состава сообщества с минимальными глобальными различиями, привнесенными процессом культуры. Сравнительный анализ 120 видов микроорганизмов в культивируемой и некультурной мокроте проводили методом метагеномного секвенирования.
46 из этих видов были идентифицированы как в некультурных, так и в культивируемых образцах. В то время как 35 были идентифицированы исключительно в некультурных образцах, а 39 были идентифицированы исключительно в культивируемых образцах. Кривые роста на основе абсорбентов были сгенерированы для распространенных патогенов муковисцидоза в легких, культивируемых в искусственных мокротных средах из изолятов образцов пациентов при нормальной концентрации кислорода 21%.
Никаких изменений с течением времени в оптической плотности при 600 нанометрах в ASM только отрицательный контроль указывал на загрязнение свободной культуры. Типичные наблюдаемые паттерны кривой роста указывают на то, что среда ASM может быть использована для генерации кривых роста с использованием оптических методов. Метагеномное секвенирование используется здесь для описания состава микробного сообщества.
Другие методы, такие как метатранскриптомное секвенирование, могут быть использованы для оценки экспрессии генов или метаболомика для оценки продукции метаболитов.
