이 프로토콜은 낭포성 섬유증 환자의 폐 미생물군유전체에 보충 산소 사용의 체외 효과를 모델링하도록 설계되었습니다. 이 미디어 레시피는 낭포성 섬유증을 앓고 있는 사람들을 위한 가래의 생리적 구성을 반영하도록 맞춤화되어 있습니다. 스파깅 과정은 다른 산소 조건하에서 배양 할 수있는 능력을 소개합니다.
인공 가래 매체에 변경하면 동시 낭포성 섬유증 및 당뇨병 환자의 다른 포도당 농도와 같은 다른 조건하에서 다른 만성 폐 질환을 모방하고 미생물 커뮤니티를 모델링 할 수 있습니다. 인공 가래 매체 준비를 위한 단계의 개요는 준비된 ASCM, ASMM 및 ASBM의 혼합을 보여줍니다. 걸레 버퍼는 pH를 6.3으로 적발하고 배지의 필터 살균을 궤도 셰이커의 콜드룸에서 수행한다.
우선 ASMM이 함유된 1리터 병에 250밀리리터의 ASCM을 추가하여 인공 가래 매체를 준비하십시오. 그런 다음 중간 병에 ASBM250 밀리리터를 추가합니다. pH 용지에 6.3의 pH에 도달하기 위해 기본 하나의 어어걸레 버퍼로 배지를 적시한다.
인공 가래 매체를 여과될 때까지 섭씨 4도에 냉장 보관하십시오. 그런 다음 여과 공정을 시작하기 위해 여과되지 않은 인공 가래 매체 200 밀리리터를 0.22 마이크로미터 모공 크기 필터를 갖춘 진공 여과 시스템으로 이송합니다. 여과 시스템을 진공 펌프에 연결한 후 진공 펌프를 켜고 챔버를 궤도 셰이커에 놓고 섭씨 4도의 차가운 방에서 분당 90 회전에서 흔들어 놓습니다.
350 밀리리터의 매체가 필터링된 후 필터를 변경하여 막힘 문제를 극복합니다. 상당한 양을 여과한 후 여과를 위한 추가 150 밀리리터 배지에서 필터링됩니다. 모든 용지가 필터링될 때까지 추가 챔버로 여과를 반복합니다.
자동 혈청 병에 인공 가래 매체에 환자 가래의 추가를 보여주는 산소 스파징의 개요. 그런 다음 밀봉 된 혈청 병을 가스 혼합물로 분리합니다. 마지막으로, 혈청 병은 후속 메타 유전체학 시퀀싱을 위해 24시간 간격으로 배양 알렉 와츠를 얻기 위해 배양된다.
혈청 병 배양 스파깅을 시작하려면 샘플 식별자, 접종 날짜 및 시간 및 대상 산소 백분율로 500 밀리리터 오토클레이브 혈청 병에 라벨을 붙입니다. 생물학적 후드에 인공 가래 배지의 24 밀리리터를 설정 중인 각 혈청 병에 추가합니다. 각 배양 조건에 대한 충분한 샘플 부피를 얻으려면 필요한 경우 멸균 인산염 완충식 식염수로 샘플을 희석한 다음 18 게이지 바늘로 가래를 균질화한 다음 각 혈청 병에 환자 가래의 1 밀리리터를 추가합니다.
다음으로, 멸균 핀셋을 사용하여, 각 혈청 병의 상단에 오토클레이브 고무 스토퍼를 놓고 스토퍼의 밑면을 만지지 않고 고무 스토퍼를 누릅니다. 후드에서 병을 제거 한 후 알루미늄 씰을 적용하고 압착하십시오. 물개 의 중심을 제거하고 알코올 닦아 병의 상단을 닦아 분센 버너 불꽃을 통해 병 씰을 전달합니다.
이제 멸균, 18 게이지 바늘을 필터로 플런저 리스트 주사기에 고정하고 부착 된 가스 방출 주사기를 병에 먼저 삽입합니다. 이제 멸균, 18 게이지 바늘을 시스템에서 가스 출력에 고정하고 가스 출력 바늘을 병에 삽입합니다. 탱크에서 산소 모니터를 통해 T 접합을 라우팅합니다.
시스템을 통해 흐르는 표적 산소 농도를 확인한 후 분당 약 5리터의 가스 흐름을 목표로 합니다. T 접합을 탱크에서 가스 출력으로 다시 라우팅합니다. 가스가 혈청 병을 통해 흐르기 시작하면 압력 게이지에 주의를 기울이고 압력이 예기치 않게 증가하면 즉시 시스템을 종료하십시오.
분당 5리터에서 1분 동안 혈청병을 통해 산소를 분리하면 10개의 공기 교환이 허용되고 내부 대기가 100% 산소의 원하는 농도에 도달할 수 있도록 합니다. 가스 방출, 18 게이지 바늘을 제거합니다. 혈청 병의 압력이 하나의 대기로 구축 할 수 있도록 한 후, 즉시 가스 출력 바늘을 제거합니다.
37섭씨 37도의 세럼 병을 분당 150회전에서 3시간, 24시간 간격으로 배양합니다. Alec Watts는 다운스트림 분석을 위해 각 24시간 간격으로 채취되고 샘플은 매번 재분리됩니다. 이 예제에서는 배양 전후의 문화가 어떤 모습일지 보여 주습니다.
유출 산소 및 pH 수준은 37°C에서 유지된 가래 샘플에 대한 배양 과정의 과정을 통해 측정하였다. 12시간 24시간의 간격을 모두 절약한 결과, 산소 농도는 시간이 지남에 따라 약 유지되었고 산소 농도는 세 가지 조건 모두에 대해 관찰되었다. 측정된 pH 수준은 시간이 지남에 따라 중요한 변화없이 생리 범위 내에 있었습니다.
미생물 부하의 비교, 다양성과 문화가 없는 가래 사이 지역 사회 조성은 배양 가래에 있는 미생물 하중에 있는 20 배 증가를 제시했습니다. 다양성 지표는 문화 과정에 의해 도입 된 최소한의 글로벌 차이와 지역 사회 구성의 보존을 나타냈다. 배양 및 비배양식 가래에서 120종의 미생물 종의 비교 분석은 대사 게놈 시퀀싱에 의해 수행되었다.
이들 종 중 46종은 배양되지 않은 시료와 배양된 샘플 모두에서 확인되었다. 35는 비배양식 샘플에서 독점적으로 확인되었으며 39는 배양 된 샘플에서 독점적으로 확인되었습니다. 흡수성 기반 성장 곡선은 정상적인 21%의 산소 농도 하에서 분리된 환자 샘플로부터 인공 가래 매체에서 배양된 일반적인 CF 폐 병원균을 위해 생성되었다.
ASM에서 600 나노미터의 광학 밀도에서 시간이 지남에 따라 변화가 없으며 부정적인 제어만오염 없는 배양을 나타냈다. 일반적인 성장 곡선 패턴은 ASM 배지가 광학 방법을 사용하여 성장 곡선의 생성에 사용될 수 있음을 나타내는 관찰된다. 메타게놈 시퀀싱은 미생물 공동체 구성을 설명하기 위해 여기에서 사용된다.
대사산물 시퀀싱과 같은 다른 기술은 대사산물 생산을 평가하기 위해 유전자 발현 또는 메타볼로믹스를 평가하는 데 사용될 수 있다.
