Bu protokoller, kistik fibrozis hastalarının akciğer mikrobiyomu üzerinde ek oksijen kullanımının in vitro etkilerini modellemek için tasarlanmıştır. Bu medya tarifi, kistik fibrozis ile yaşayan insanlar için balganın fizyolojik bileşimini yansıtmak için özel olarak tasarlanmıştır. Sparging işlemi, farklı oksijen koşulları altında kültür yeteneğini tanıtır.
Yapay balgam ortamında yapılan değişiklikler, diğer kronik akciğer hastalıklarını taklit etmesine ve eşzamanlı kistik fibrozis ve diyabet hastalarında farklı glikoz konsantrasyonları gibi diğer koşullar altında mikrobiyal toplulukları modellemesine izin verir. Yapay balgamlı orta hazırlık adımlarına genel bakış, hazırlanan ASCM, ASMM ve ASBM'nin karıştırılmalarını göstermektedir. Paspas tamponu pH'ı 6.3'e titratlamak için kullanılır ve ortamın filtre sterilizasyonu yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde soğuk bir odada gerçekleştirilir.
Başlangıç olarak, ASMM içeren bir litrelik şişeye 250 mililitre ASCM ekleyerek yapay bir balgam ortamı hazırlayın. Daha sonra orta şişeye 250 mililitre ASBM ekleyin. Bir pH kağıdında 6,3 pH'a ulaşmak için ortamı temel bir azı dişi paspas tamponu ile titrat.
Suni balgam ortamını filtrasyona kadar dört santigrat derecede soğutun. Daha sonra filtrasyon işlemine başlamak için, 200 mililitre filtresiz suni balgam ortamını 0,22 mikrometre gözenek boyutu filtresine sahip bir vakum filtrasyon sistemine aktarın. Filtrasyon sistemini vakum pompasına bağladıktan sonra, vakum pompasını açın, ardından odayı dört santigrat derecede soğuk bir odada dakikada 90 dönüşte sallayarak yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin.
Tıkanma sorununun üstesinden gelmek için 350 mililitre orta filtrelendikten sonra filtreyi değiştirin. Önemli miktarda filtrelendikten sonra, filtrasyon için ekstra 150 mililitrelik bir ortamda. Tüm ortam filtrelenene kadar filtrasyonunu ek bölmelerle tekrarlayın.
Otoklavlı serum şişesinde yapay balgam ortamına hasta balgamı eklendiğini gösteren oksijen sıçramasına genel bakış. Sonra mühürlü serum şişesini bir gaz karışımı ile serpin. Son olarak, serum şişesi, sonraki meta genomik dizileme için 24 saat aralıklarla Alec Watts kültürünü elde etmek için inkübe edilir.
Serum şişesi kültürünün sıçramasına başlamak için, 500 mililitre otoklavlı serum şişelerini örnek tanımlayıcılar, aşılama tarihi ve saati ve hedef oksijen yüzdesi ile etiketle. Biyolojik bir kaputta, kurulan her serum şişesine 24 mililitre yapay balgam ortamı ekleyin. Her kültür durumu için yeterli bir örnek hacmi elde etmek için, gerekirse, numuneyi steril fosfat tamponlu salin ile seyreltin, ardından 18 kalibrelik bir iğne ile homojenize balgam ve her serum şişesine bir mililitre hasta balgalı ekleyin.
Daha sonra, steril cımbız kullanarak, otoklavlı kauçuk durdurucuları her serum şişesinin üstüne yerleştirin, durdurucunun altına dokunmadan lastik durdurucuları bastırın. Şişeleri kaputtan çıkardıktan sonra alüminyum contaları uygulayın ve kıvrıklayın. Contaların orta parçasını çıkarın ve şişelerin üst kısmını alkolle silin ve şişe mührünü bir Bunsen brülör alevinden geçirin.
Şimdi steril, 18 kalibrelik bir iğneyi filtreli bir piston listesi şırıngasına sabitleyin, önce yapıştırılmış gaz salınım şırıngasını şişeye yerleştirin. Şimdi steril, 18 kalibrelik bir iğneyi sistemden gaz çıkışına sabitlayın ve gaz çıkış iğnesini de şişeye yerleştirin. Tanklardaki T bağlantılarını oksijen monitöründen geçirin.
Sistemden akan hedef oksijen konsantrasyonu doğrulanınca, dakikada yaklaşık beş litre gaz akışını hedefle. T bağlantılarını tanklardan gaz çıkışına yönlendirin. Gaz serum şişeden akmaya başladığında, basınç göstergesine çok dikkat edin ve basınç beklenmedik şekilde artarsa, sistemi hemen kapatın.
Çalıştırildikten sonra, oksijen serum şişesinde dakikada beş litre bir dakika boyunca zıplar, ayarlar 10 hava değişimine izin verir ve iç atmosferin istenen% 100 oksijen konsantrasyonuna ulaşmasını sağlar. Gaz salınımını çıkarın, 18 kalibrelik iğne. Serum şişeslerindeki basıncın tek bir atmosfere inşa etmesine izin verdikten sonra, gaz çıkış iğnesini hemen çıkarın.
Serum şişelerini 37 santigrat derece inkübatör çalkalayıcıda dakikada 150 dönüşte 3, 24 saat aralıklarla kuluçkaya yatırın. Alec Watts aşağı akış analizi için her 24 saat aralığında alınır ve numuneler her seferinde yeniden ayrıştırır. Buradaki örnek, bir kültürün inkübasyondan önce ve sonra nasıl görünebileceğini gösterir.
37 santigrat derecede tutulan balgam örnekleri için kültür süreci boyunca çıkış oksijeni ve pH seviyeleri ölçüldü. Her iki 12 saat ve 24 saatlik serpinti aralıklarıyla, her üç durum için de gözlenen oksijen konsantrasyonunda ılımlı bir düşüşle oksijen konsantrasyonları zaman içinde yaklaşık olarak korundu. Ölçülen pH düzeyleri fizyolojik aralıktaydı ve zaman içinde önemli bir değişiklik olmadı.
Kültürsüz ve kültürlü balgam arasındaki mikrobiyal yük, çeşitlilik ve topluluk kompozisyonunun karşılaştırılması, kültürlü balgamda mikrobiyal yükte 20 kat artış olduğunu ortaya koydu. Çeşitlilik ölçümleri, kültür süreci tarafından ortaya konan minimum küresel farklılıklarla topluluk kompozisyonunun korunmasını gösterdi. Kültürlü ve kültürsüz balgamdaki 120 mikrobiyal türün karşılaştırmalı analizi meta genomik dizileme ile yapıldı.
Bu türlerin 46'sında hem kültürsüz hem de kültürlü örneklerde tanımlanmıştır. 35'i sadece kültürsüz örneklerde, 39'u ise sadece kültürlü örneklerde tanımlanmıştır. Normal %21 oksijen konsantrasyonu altındaki hasta örnek izolelerinden yapay balgam ortamlarında kültürlenen yaygın CF akciğer patojenleri için emici bazlı büyüme eğrileri oluşturulmuştır.
ASM'deki 600 nanometredeki optik yoğunlukta zaman içinde değişiklik olmaması, kontaminasyonsuz kültürün sadece negatif kontrolünü gösteriyordu. Asm ortamının optik yöntemler kullanılarak büyüme eğrilerinin üretimi için kullanılabileceğini gösteren tipik büyüme eğrisi desenleri gözlenmiştir. Metaagenomik dizileme burada mikrobiyal topluluk kompozisyonunu tanımlamak için kullanılır.
Metatranscriptomik dizileme gibi diğer teknikler metabolit üretimini değerlendirmek için gen ekspresyon veya metabolomik değerlendirmek için kullanılabilir.
