Два метода пилинга, продемонстрированные здесь, изолируют отдельные стержневые субклеточные компартменты и могут помочь выявить важные физиологические процессы, происходящие в каждом специализированном отделении в здоровых и больных стержнях. Выделение различных стержневых клеточных отсеков сетчатки мыши может быть сложной задачей. Эти простые методы используют недорогие и обычные лабораторные материалы для надежного выделения стержневых субклеточных компартментов для анализа белка.
Для начала поместите лист фильтровальной бумаги в чашку Петри, наполненную буфером Ames HEPES, наполненным 100% кислородом. Затем, используя широкодисперсную передаточную пипетку, перенесите один прямоугольник сетчатки, рассеченный от двух-трехмесячной мыши C57 Black 6J. Ориентируйте разделенную сетчатку вверх и убедитесь, что фоторецепторы обращены вниз к нижней части чашки.
Затем, используя пинцет, слегка обхватите боковые стороны половинчатой сетчатки и переместите ее поверх фильтровальной бумаги. Как только сетчатка будет центрирована, переместите фильтровальную бумагу вверх, чтобы разрезанная пополам сетчатка коснулась фильтровальной бумаги, чтобы создать внешний сегмент стержня, или ROS для адгезии фильтрующей бумаги. Осторожно поднимите фильтровальную бумагу с прикрепленной сетчаткой из буфера Ames HEPES.
Положите нижнюю сторону фильтровальной бумаги на бумажное полотенце и два-три раза смажьте для высыхания. Добавьте каплю Ames HEPES на боковую часть фильтровальной бумаги с сетчаткой и снова поместите фильтровальную бумагу на бумажное полотенце для высыхания. Затем поместите фильтровальную бумагу с сетчаткой обратно в чашку Петри и, используя пинцет, осторожно оттолкните все края половинчатой сетчатки вверх и подальше от фильтровальной бумаги со всех сторон.
Деликатно отсоедините сетчатку от фильтровальной бумаги, коснувшись только крайнего периметра сетчатки, чтобы сохранить ее структурную целостность. Затем поднимите фильтровальную бумагу из чашки Петри и удалите лишнюю жидкость на бумажном полотенце, убедившись, что сторона, контактирующая с сетчаткой, не контактирует с бумажным полотенцем. Поместите фильтровальную бумагу с частичным слоем ROS в меченую трубку на льду и держите очищенную сетчатку погруженной в буфер Ames HEPES.
Повторите процесс пилинга для этой половинчатой сетчатки примерно семь-восемь раз, чтобы удалить весь слой АФК. После каждого пилинга поместите фильтровальную бумагу в одну и ту же трубку, чтобы объединить все АФК, выделенные из одной половинки сетчатки. Держите трубку, содержащую все кожуры фильтровальной бумаги изолированного АФК, на льду для немедленного использования.
Используя пинцет, перенесите оставшуюся очищенную сетчатку в соответствующим образом маркированную трубку и держите трубку на льду для немедленного использования. Чтобы подготовить образец сетчатки к лиофилизации, поместите лист фильтровальной бумаги и переложите половинчатую сетчатку в чашку Петри, наполненную холодным буфером Рингера. Далее, используя пинцет, осторожно переверните сетчатку так, чтобы она была ориентирована вогнутой вверх и переместите ее, чтобы она опиралась поверх фильтровальной бумаги.
Поднимите фильтровальную бумагу по краям вверх, чтобы разрезанный пополам кусок сетчатки коснулся фильтровальной бумаги. Продолжайте поднимать фильтровальную бумагу из раствора Рингера. Затем поместите нижнюю сторону фильтровальной бумаги на бумажное полотенце и тщательно смажьте два-три раза, чтобы удалить лишнюю жидкость.
Далее возьмите фильтровальную бумагу пинцетом и добавьте каплю холодного Ringer's на бок фильтровальной бумаги с сетчаткой. Опять же, поместите фильтровальную бумагу на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость. Храните каждый прилипший образец сетчатки и фильтровальной бумаги в чашке Петри, наполненной холодными образцами Рингера, пока они не будут готовы заморозить все образцы.
Затем, используя пинцет, поднимите каждый образец из буфера холодного рингера, убедившись, что пинцет контактирует только с краями фильтрующей бумаги, избегая половинки сетчатки. Поместите нижнюю сторону каждой фильтровальной бумаги на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость. Затем добавьте каплю холодного PBS на сторону фильтровальной бумаги, где приклеивается сетчатка, и снова нанесите фильтровальную бумагу на бумажное полотенце.
Поместите все кусочки фильтровальной бумаги в чашку Петри и, используя безворсовую папиросную бумагу, удалите лишнюю жидкость, окружающую фильтровальную бумагу. Затем плотно оберните всю посуду алюминиевой фольгой и убедитесь, что края алюминиевой фольги закреплены и плавно вдавлены в дно чашки Петри. Проколите несколько отверстий от 0,1 до 0,2 миллиметра в крышке из алюминиевой фольги.
Затем, используя металлические щипцы, постепенно опустите покрытую алюминиевой фольгой чашку Петри в жидкий азот. Храните образцы в жидком азоте до готовности к лиофилизации. Для лиофилизации поместите покрытую алюминиевой фольгой чашку Петри в флягу для сублимационной сушки и прикрепите ее к лиофилизирующей машине в соответствии с протоколом производителя.
Лиофилизируйте сетчатку в течение 30 минут. После лиофилизации соберите стержень наружного и внутреннего сегмента, аккуратно положив небольшой кусочек ленты поверх лиофилизированной сетчатки и приложив небольшое давление пинцетом, чтобы убедиться, что он связывается с фоторецепторным слоем. Медленно снимите ленту и убедитесь, что ROS и RIS прилипли к ленте.
Тонкая белая пленка будет присутствовать на трещиноватой поверхности. Это РИС. Чтобы отделить эту РИС, поместите еще один кусок ленты и надавите лентой вниз на трещиноватую поверхность.
Затем поместите кусок ленты только с оранжево-розовым слоем в микроцентрифужную трубку, помеченную как ROS, и кусочки ленты с тонким белым слоем в другую трубку с маркировкой RIS. Затем, используя ленту, соберите оставшуюся ткань сетчатки, расположенную на фильтровальной бумаге, отклеив толстый белый слой. Затем поместите этот изолят в трубку с маркировкой OIS.
При использовании в тот же день храните изолированные слои от лиофилизированной сетчатки при комнатной температуре. У животных, адаптированных к темноте, распределение GNAT1 и ARR1 близко соответствовало их известным распределениям в темном состоянии, где сигнал GNAT1 был заметно сильнее в изоляции ROS, а сигнал ARR1 был более надежным в изоляции ROS. Количественная оценка сигналов GNAT1 и ARR1 показала значительные различия между условиями темного света для GNAT1 и ARR1 в образцах ROS и ROS.
Как в темных, так и в светоадаптированных образцах сигналы G beat 5S, цитохром C и актин исключены из образцов ROS, демонстрируя отсутствие загрязнения из других клеточных слоев. Кроме того, сигнал G beta 5L был хорошо виден в образцах ROS. Сканирующая электронная микроскопия поверхностей интактной и шелушащейся лиофилизированной сетчатки показала, что перед отслаиванием клейкой лентой поверхность интактной лиофилизированной сетчатки близко соответствовала характерной цилиндрической АФК.
После первоначального лущения ленты АФК и РИС, по-видимому, были полностью удалены, о чем свидетельствует однородный ядерный слой, присутствующий на поверхности оставшейся, очищенной, лиофилизированной сетчатки. Последующие ленточные пилинги удаляют РИС со свободной поверхности отслаивающегося слоя. Этот метод также продемонстрировал, что иммунореактивность GRK1 была наиболее интенсивной в образцах АФК в сетчатке, подвергшихся воздействию света, и отсутствовала в образцах OIS.
И наоборот, образцы АФК и РИС показали слабый сигнал для PKC альфа, который обычно не обнаруживается в АФК или РИС путем иммунофлуоресцентного окрашивания. Наконец, неоптимальное лущение ленты может привести к слегка загрязненным образцам. Образец RIS был загрязнен некоторым образцом OIS, продуцирующим как G beta 5L, так и G бета 5S диапазоны, а также более высокий альфа-сигнал PKC.
Необходимо соблюдать осторожность при лиофилизации сетчатки. Если используется неправильная техника лиофилизации, сетчатка может расплавиться, что делает невозможным выделение различных палочковых субклеточных слоев лентой. Использование этого метода лущения ленты в сочетании с qRT-PCR позволило отделить транскрипты фоторецепторов от остальной части сетчатки.
