Механические силы, генерируемые клетками, необходимы для правильного функционирования в различных органах по всему телу. Плюс кишечник мочевого пузыря, сердца и других. Эти органы должны генерировать устойчивые паттерны сокращения и расслабления клеток, чтобы поддерживать внутреннее кровоостанавливающее состояние.
Аномальное сокращение гладкомышечных клеток может привести к возникновению различных расстройств, в том числе кишечная дисмоторика характеризует аномальные паттерны кишечника с сокращением мышц, а также такие состояния, как гиперактивный или неактивный мочевой пузырь. А в дыхательных путях некоторые мышечные клетки, которые сокращают любые нерегулярные паттерны, могут вызвать астматическую гиперчувствительность. Очевидно, что сократительные механизмы в клетках и тканях могут привести к заболеваниям, которые требуют вариантов лечения.
И поскольку эти условия могут напрямую проистекать из дисфункционального сократительного поведения клеток, становится логичным и необходимым измерять саму сократительную функцию клеток при скрининге потенциальных кандидатов на лекарства. Следуя недавним достижениям в области микротехнологий, мы разработали удобный для пользователя анализ на основе микропластин, который позволяет количественно измерять сокращение одной ячейки. В сотнях тысяч клеток называется flex, также известный как флуоресцентно меченые эластомерные сжимаемые поверхности.
В этом подходе мы встраиваем флуоресцентные белковые микромодули и, следовательно, мягкие пленки, которые деформируются и сжимаются, когда клетки прикладывают к ним силы тяги. Важно отметить, что белковые микроструктуры ограничивают положение, форму и область распространения клеток. Унифицированные условия испытаний позволяют проводить простые измерения, основанные только на их размерах.
В целом, платформа, которая включает в себя модуль анализа изображений на основе браузера, позволяет легко анализировать сжимаемую клеточную силу, не требуя деликатных процедур обработки или регистрации фидуциарных маркеров, и может управляться любым исследователем с базовыми клеточными культурами и простым флуоресцентным микроскопом с низким увеличением. Эта технология должна быть разработана с учетом конечного пользователя и направлена на снижение барьера для входа для любого лабораторного ученого для изучения клеточной силовой биологии Начните с добавления 20 миллилитров среды в хроническую трубку, получите 24-луночную пластину, предназначенную для анализа сократимости клеток. Установите пипетку на 500 микролитров и получите клеточное ситечко для клеточного патогена.
Снимите крышку на 24-луночной пластине, поднимите пластину так, затем приступайте к аккуратному снятию слоя пластика поверх пластины. Осторожно опустите пластину обратно вниз. Аспирируйте только верхний слой PBS из каждой скважины, чтобы предотвратить любой разлив.
Теперь, по одному ряду за раз, извлеките оставшиеся PBS из скважины и быстро заполните 500 микролитрами клеточной среды. Осторожно встряхните тарелку и постучите по ее стороне, чтобы убедиться, что все дно колодца покрыто раствором. После того, как все колодцы будут заполнены средой, отложите пластину в сторону.
На этом этапе извлеките культуру клеток из инкубатора. Мы будем проводить солидный протокол ассоциации. Целью этого протокола является создание суспензии 50 000 клеток на миллилитр.
Перед посевом клеток обязательно процедите свои клетки один раз через ситечко, чтобы разбить скопления клеток на отдельные клетки, аккуратно поместите 500 микролитров вашего клеточного раствора в каждую лунку. После посева клеток важно оставить пластины на час, чтобы клетки могли оседать непосредственно на узорах. По прошествии часа поместите тарелку в инкубатор на ночь.
Вторая часть эксперимента состоит из добавления лекарств к 24-луночной пластине и флуоресцентной визуализации пластины. Для этой части протокола у нас есть два важных требования для обеспечения надежной жизнеспособности и реакции клеток. Во-первых, конечная концентрация ДМСО в колодцах с ячейкой составляет не более 1%, что означает, что нам нужно сделать 100 полное разведение из наших запасов лекарств.
Во-вторых, мы не можем добавить ДМСО непосредственно в скважины, потому что он рухнет на дно этого смешивания, а затем повредит клеткам с высокой концентрацией. Вместо этого мы должны создать промежуточный раствор препарата DMS0 и среды, который мы можем тщательно смешивать вместе, чтобы избежать высокого местного воздействия DSSO на клетки. В этом протоколе мы будем делать шестиступенчатое восьмикратное разведение, которое охватывает диапазон от 40 микромоляров до одного наномоляра Создайте шестиступенчатую восьмикратную серию разбавления путем переноса 30 микролитров исходного раствора лекарственного средства в последовательные 210 микролитровых объемов ДМСО и тщательного смешивания между каждым этапом переноса В нашем эксперименте, мы будем оценивать эффект блеббистатина.
на мочевой пузырь человека через мышечные клетки. Чтобы соответствовать обоим требованиям, мы сначала создадим промежуточный препарат DMSO и медиа-раствор. Это приводит к 16,7-кратному разбавлению ДМСО.
Затем мы добавим этот промежуточный раствор лекарственного средства в наши клетки, используя пропорции, дающие дополнительное шестикратное разведение, в результате чего получится в общей сложности 100 полных разведений и конечная концентрация 1% ДМСО Для достижения этого для каждого запасного раствора лекарственного средства смешайте 30 микролитров лекарственного средства в 470 микролитрах клеточной питательной среды, затем перенесите 200 микролитров этого промежуточного раствора в соответствующую скважину на 24-луночной пластине, который содержит 1000 микролитров в каждой лунке. Это в совокупности дает 1% конечную концентрацию DMSO Incubate в течение соответствующего периода времени. В нашем эксперименте мы инкубируем в течение 30 минут, когда вы будете готовы к изображению, добавьте живое ядерное пятно по всей вашей скважине, добавьте от одного до 10 000 разведений из запаса.
Дайте ему высиживаться в течение дополнительных 15 минут. Когда вы будете готовы к изображению, вам понадобится флуоресцентный микроскоп, который оснащен для изображения флуоресцентных каналов как для меченых ядер клеток, так и для флуоресцентного красителя. Микрошаблоны помечены тем, что в нашем примере является каналом tri C.
Теперь мы будем флуоресцентной визуализацией ядер блеббистатина, чтобы идентифицировать отдельные клетки, обязательно визуализируйте ядра пятнистых клеток в том же положении, в котором вы просматриваете микрорайнер, чтобы их можно было выровнять во время анализа. Загрузите полученные изображения на компьютер, убедитесь, что изображения помечены правильно, так что каналы шаблона заканчиваются подчеркиванием PT. А изображения в ядерном канале заканчиваются подчеркиванием дапи. Теперь мы будем конвертировать изображения tif в изображения PNG, используя изображение J Как только изображение J открыто, загружайте по одному каналу за раз.
Сначала мы будем загружать канал паттерна и регулировать контрастность, чтобы максимизировать сигнал и минимизировать фон. Кроме того, мы будем сглаживать изображение. Как только изображение будет изменено по нашему вкусу, мы изменим тип изображения на восемь бит.
Затем экспортируйте изображение в формате PNG. Затем установите флажок, используйте метки фрагментов в качестве имен файлов. Создайте новую папку с именем PNG.
Затем сохраните файлы PNG там, чтобы проанализировать изображения, перейдите в Biodock dot AI, создайте учетную запись и свяжитесь с авторами, чтобы получить бесплатный доступ к модулю анализа. Войдите в систему после создания учетной записи. Здесь вы сможете загружать новые изображения.
Мы назовем этот новый пакет, данные веб-эксперимента JoVE. Теперь мы можем импортировать изображения, перетащив их, а затем перетащив их, нажмите OK.At этой точке, выберите свои данные. Затем нажмите «Анализировать», прокрутите вниз до модуля с надписью «Анализ сократимости», затем нажмите «Выбрать».
Установите увеличение на то же значение, которое вы использовали для визуализации Как только данные будут завершены, нажмите на него, после чего мы сможем выбрать данные загрузки. Как только данные загружены, мы можем увидеть наложенные пары изображений для каждого введенного изображения. У нас также есть доступ к сводной статистике, которая даст нам среднее сокращение для каждого набора клеток.
Единицей измерения сжатия является пиксель. Глядя на данные, мы можем видеть здесь, что в лунках, обработанных только ДМСО, наблюдалось гораздо более высокое сокращение клеток по сравнению с теми клетками, которые обрабатывались блеббистатином. У нас также есть доступ к данным для каждого отдельного шаблона, который был обнаружен на любом из изображений.
Это дает нам подробную информацию о местоположении изображения, происхождении изображения, типе положения, количестве ячеек, либо ноль один, либо более единицы, размере микрорайона и расчетном сокращении ячеек. Эта прокладка состоит из каждого идентифицированного паттерна внутри микропластины. Шаблоны с одной ячейкой из этого списка были средними для вычисления среднего сокращения для изображения PNG в другом файле.
Вы можете сортировать и анализировать данные одной ячейки по мере необходимости для эксперимента. Для этой части видео мы будем отображать репрезентативные данные, которые можно собрать с 24-луночной пластины, показывающей эти данные ответа от гладкомышечных клеток мочевого пузыря, обработанных двумя различными препаратами. Это изображения скважин, обработанных ДМСО и блеббистатином соответственно.
Здесь мы можем видеть, что клетки, обработанные только ДМСО, демонстрируют большое количество контрактных микромоделей, но клетки, обработанные блеббистатином, были больше и открыты для того, чтобы отметить, что сокращение меньше. Данные в этой гистограмме отображают вариационную сократимость клеток в результате различных обработок клеток. Центр распределения для клеток, обработанных блеббистатином, ниже, чем центр распределения для клеток, которые были обработаны DMSO.
Это согласуется с информацией, отображаемой на предыдущих изображениях. Потому что клетки, которые обрабатывали блеббистатином, проявляли гораздо меньшее сокращение. Это означает, что лечение блеббистатином значительно расслабляет клетки.
Каждый из этих наборов данных вносит свой вклад в точку на кривой реакции дозы, которая может быть собрана с одной 24-луночной пластины в соответствии с протоколами, показанными на видео. Здесь мы можем видеть, что цитохалазин D является более мощным, чем блеббистан, о чем свидетельствуют более низкие значения сокращения, учитывая более высокие концентрации препарата. Если вы хотите значительно масштабировать свои эксперименты, доступна версия пластины на 384 скважины, и ее можно использовать с автоматизацией для значительного масштабирования экспериментов.
Эти данные собираются с 384-луночной пластины, вместо того, чтобы иметь шесть стадий разбавления для каждого препарата на 24-луночной пластине, пластина 384 скважины позволяет нам проводить 20 стадий разведения для каждого препарата с несколькими репликами. Технология Snowflakes уникальна. Это позволяет визуализировать одноклеточное сокращение с помощью микроскопии, что до сих пор было невозможно.
Таким образом, технология опирается на форму метрик, которая построена с флуоресцентно меченым белком. Систематическая картина формируется для клеточного сокращения и позволяет точно измерить модуляцию контракта фенотипа любым данным препаратом. Конечно, эта технология все еще активно разрабатывается для применения и многих различных областей заболеваний, таких как астма, сердечно-сосудистые заболевания, воспаление иммунной онкологии и, конечно же, любой из наших признаков заболевания, где аномальное клеточное сокращение играет ключевую роль в прогрессировании заболевания.
Как мы демонстрируем, эта технология на основе микроструктурирования для измерения сократимости клеток предлагает упрощенную альтернативу традиционной микроскопии силы тяги, обеспечивая интуитивно понятный анализ, наблюдая за сокращением паттерна и обеспечивая разрешение одной клетки в больших клеточных популяциях. По некоторым соображениям, этот метод может создавать проблемы для использования клеток, которые либо слишком малы, таких как Т-клетки и нейтрофилы, либо типов клеток, которые не прилипают. Кроме того, клетки, которые еженедельно связываются, связываются друг с другом преимущественно или которые не полностью распространяются, не будут производить измеримые сократительные сигналы.
Пользователи технологии должны тщательно оценивать различные возможные составы клеточной культуральной среды для их конкретного типа клеток. поскольку различные компоненты, факторы роста, уровни сыворотки и чувствительность к рН могут влиять на переменное поведение. Оптимизация протоколов должна продолжать масштабирование любых экспериментальных рабочих процессов.
В конечном счете, если разрешение одной клетки не требуется, или если тип клетки-мишени имеет минимальную способность к распространению, то для таких экспериментов могут быть использованы традиционные методы микроскопии силы притяжения. В противном случае мы надеемся, что этот инструмент предоставит дополнительный путь для клеточных биологов для изучения клеточного сокращения и проведения своих исследований.
