Этот протокол позволяет последовательно создавать высокоточные белковые микромодулины любой желаемой формы, в частности изолированные островки паттернов для изучения клеточных кластеров. Эта техника может быть использована для изготовления изолированных островных микрошариков любой формы и размера всего за один шаг, тогда как ранее для создания таких узоров требовалось два отдельных шага. Начните с смешивания PDMS в правильном соотношении отверждающего агента к основанию, как описано в инструкциях производителя.
Инкубировать при комнатной температуре и давлении в течение 15 минут, затем дегазировать смесь под вакуумом в течение 15 минут. Налейте PDMS в основную форму и переложите ее в инкубатор, установленный на 37 градусов цельсия, чтобы вылечить за одну ночь. Извлеките главную форму из инкубатора и дайте ей остыть до комнатной температуры.
Пока основная форма охлаждается, обтекайте ультразвуком 25-миллиметровый покров в этаноле в течение 10 минут. Используйте столько обложек, сколько составляет количество подготавливаемых марок. Тщательно промойте крышки водой DI и высушите их с помощью фильтрованного воздушного пистолета.
Обработайте крышки плазмой в течение одной минуты с помощью плазмоочистителя под высоким вакуумом. Медленно высвобождайте вакуум после обработки, чтобы предотвратить перемещение крышек внутрь камеры. Покройте каждую крышку 100 микролитрами флуоресцентного меченого белкового раствора в помещении, лишенном прямых солнечных лучей или верхнего освещения.
Накройте образцы для дополнительной защиты от света и высиживайте их в течение 20 минут при комнатной температуре. Тщательно промойте каждую крышку водой DI. Удалите лишнюю воду с поверхности, осторожно постукивая по бокам каждого чехла на бумажное полотенце или аналогичный абсорбирующий материал.
Дайте покровным листам полностью высохнуть, оставив их непокрытыми в темноте в течение не менее 30 минут. Пока покрытые белком покровы высыхают, снимите штамп PDMS с главной формы, разрезав его скальпелем или любым острым лезвием. Обрабатывайте штампы PDMS плазмой в течение двух минут при высоком вакууме.
Поместите штампы в емкость с крышкой под вытяжной капюшоном, затем покройте каждую марку тонким слоем 10%3-APTMS, разбавленным в 100% этаноле. Накройте емкость штампами и высиживайте при комнатной температуре в течение пяти минут. Тщательно промойте каждый штамп с обеих сторон водой DI.
Поместите штампы в чистую емкость и покройте их 2,5% глутаровым альдегидом, приготовленным в воде DI. Накройте штампы и высиживайте их при комнатной температуре в течение 30 минут. Тщательно промойте штампы водой DI.
Удалите лишнюю воду с поверхности, как описано ранее, и дайте штампам высохнуть непокрытыми в течение 30 минут. Если через 30 минут покрытые белком чехлы или штампы не полностью высохли, используйте фильтрованный воздушный пистолет, чтобы полностью высушить их. Надавите на узорную сторону штампов на крышки с достаточным давлением, чтобы они могли полностью соприкоснуться.
Оставьте его нетронутым в течение 15 минут. Затем аккуратно снимите штампы PDMS с обложек. С помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующим фильтром проверьте точность узорчатых обшивок.
Немедленно используйте узорчатые крышки или храните их вдали от прямого света до дальнейшего использования. Перед приготовлением предшественника гидрогеля PAA удалите эфир акриловой кислоты NHS из холодильника, чтобы достичь комнатной температуры перед открытием. Приготовьте сменную крышку тарелки, стерилизовав ее 70%-ным этанолом, затем инкубируйте ее под ультрафиолетовым светом в шкафу для биобезопасности в течение не менее 30 минут перед использованием.
Под вытяжной капюшон добавьте 1,25 миллилитра 40% акриламида, приготовленного в воде DI, в коническую трубку объемом 15 миллилитров. В ту же пробирку добавляют 175 микролитров бис-акриламидного раствора, приготовленного в воде DI. Затем добавьте 500 микролитров 10X PBS, а затем 2,915 миллилитра воды DI.
Пипетка 969 микролитров этого предшественника в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и хранит остальные при четырех градусах Цельсия до двух недель. Измерьте от 50 до 100 миллиграммов APS в свежей микроцентрифужной трубке и разбавьте ее до 100 миллиграммов на миллилитр в воде DI. Откройте эфир NHS в капоте и тщательно измерьте до трех миллиграммов NHS в микроцентрифужной трубке.
Разбавьте эфир NHS до одного миллиграмма на миллилитр в 1X PBS. Под вытяжным капотом добавьте два микролитра TEMED в микроцентрифужную трубку, содержащую 969 микролитровую аликвоту предшественника PAA. Добавьте 15 микролитров одного молярного HCL, чтобы уменьшить рН раствора гидрогеля и избежать гидролиза эфира NHS.
Добавьте в трубку 10 микролитров эфирного раствора NHS. Выполните следующие действия в шкафу биобезопасности. Аккуратно поместите 30-миллиметровую крышку в среднюю часть комплекта крышки тарелки с 3-APTMS и глутаровым альдегидом стороной вверх и прикрутите пластиковое кольцо сверху.
Настройте узорчатую крышку с минимальным воздействием света, чтобы подготовиться к следующему шагу. Пипетка пять микролитров раствора АФС в аликвотную трубку предшественника ПАА, затем инвертируется и перемешивается. Сразу же пипетку 35 микролитров этого раствора на 30-миллиметровый покров.
Поместите узорчатую крышку на раствор белковой стороной вниз. Будьте осторожны, чтобы не создавать пузырьки воздуха в гидрогеле. Защитите гидрогель от света и дайте ему полимеризоваться в течение 90 минут.
После того, как гидрогель полимеризовался, используйте лезвие бритвы или скальпель, чтобы удалить верхнюю крышку, убедитесь, что крышка не падает назад или не скользит с геля после удаления, чтобы избежать разрушения рисунка на поверхности геля. Чтобы пассивировать любой оставшийся эфир NHS в гидрогеле, добавьте два миллилитра стерильного PBS в гель и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 45 минут. Немедленно подготовьте гели для экспериментов или храните их на ночь в стерильном PBS при четырех градусах Цельсия до дальнейшего использования.
Гидрогели были косвенно структурированы флуоресцентным фибронектином для визуализации и измерения клеточных сил тяги в кластерах и создания островных узоров заранее определенного размера и формы. Качество рисунка напрямую связано с точностью мастер-формы, из которой был отлит штамп PDMS. Этот метод может изготовить изолированные, четко определенные островные узоры предопределенной формы.
Точки адгезии фибронектина присутствовали только в пределах желаемой области острова. Эти изолированные островки точек адгезии дополнительно позволили лучше контролировать форму кластера. Покрытие штампов PDMS двумя маленькими 3-APTMS имеет решающее значение, поскольку оно ограничит эффективность метода удаления, в то время как слишком много создаст оранжевый остаток на поверхности штампа.
Созданные здесь паттерны могут быть использованы для определения клеточных тяговых сил как в отдельных клетках, так и в кластерах, что дает представление об их способности поддерживать механический гомеостаз.
