Наш протокол описывает, как такие методы, как вытягивающие анализы аналитической хроматографии исключения размера, аналитическое ультрацентрифугирование и анализ гистонового шаперонирования, могут быть использованы для подтверждения того, является ли белок гистоновым шапероном. Методы, описанные здесь, при использовании тандема, могут быть применены непосредственно для характеристики предполагаемого шаперона. он мог бы согласиться с техникой структурной биологии.
Методики применимы в области исследования хроматина. Тем не менее, отдельные методы могут быть применены к любому другому белку, представляющему интерес, по мере необходимости. Продемонстрировать эту процедуру будет г-н Сураджит Ганди, аспирант из моей лаборатории, для сложного анализа вытягивания;
Арчана Самал, аспирант, вместе с г-ном Руширом К. Бобде за аналитический эксперимент по ультрацентрифугированию; г-н Соманат Барал, аспирант; вместе с г-ном Кетулом Сахараном для плазмидного суперспирального анализа Во-первых, смешайте пятимикромолярные гистоновые шапероны с 20-микромолярными димерами H2A / H2B в 300 микролитрах буфера равновесия. Центрифугируйте комплекс гистонового шаперона H2A/H2B для удаления любого осадка.
Загрузите образец в спиновой столбец, предварительно уравновешенный буфером равновесия. Вымойте колонну объемом 100 колонн или четырьмя миллилитрами промывочного буфера, чтобы удалить лишний димер H2A/H2B. Затем смешайте комплекс гистонового шаперона H2A/H2B с 20-60-микромолярным тетрамером H3/H4.
Перемойте колонну объемом 100 колонн или четырьмя миллилитрами промывочного буфера, чтобы удалить любой несвязанный тетрамер H3/H4, а затем элюируйте образцы буфером элюирования. Подвергайте элюированные образцы 18%SDS-PAGE. Затем окрашиваем Coomassie блестящим синим R250 и визуализируем гель.
Очистите димер H2A/H2B, тетрамер H3/H4 в гистоновом шапероне индивидуально с помощью диализного буфера с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии. Сохраните буфер от запуска, чтобы подготовить дальнейшие разведения в дальнейшем и использовать в качестве эталона в ячейке AUC. Для образцов AUC смешайте очищенные шапероны с димером или тетрамером в отдельных пробирках до конечного объема 450 микролитров, используя сохраненный диализный буфер, чтобы достичь OD280 от 0,3 до 0,6.
Соберите ячейку с двухсекторным центральным элементом и кварцевыми окнами, снабженными аналитической ультрацентрифугой с детектором поглощения. Заполните 400 микролитров раствора образца и 420 микролитров диализного буфера в эталонный и образец секторов ячейки соответственно. Взвешивайте и точно балансируйте ячейки и загружайте их в титановый ротор с четырьмя отверстиями.
Выровняйте ячейки, используя метки в нижней части ячеек и ротора. Загрузите ротор в центрифугу, закройте крышку и начните работу, что позволит создать вакуум и стабилизировать температуру. Для анализа данных рассчитать плотность и вязкость для буферных компонентов белков и частичный удельный объем на основе аминокислотного состава белка с помощью программы SEDNTERP.
Загрузите данные с машины AUC в программу SEDFIT. Определите мениск, красную линию, нижнюю часть ячейки, синюю линию и зеленые границы анализа данных. Выберите Непрерывное распределение CS в качестве модели.
В разделе параметров установите максимальное разрешение до 100. Затем установите минимальный коэффициент осаждения равным нулю и максимальным от 10 до 15. Установите коэффициент трения равным 1,2 изначально и выберите float, чтобы получить соотношение из данных.
Установите коэффициент F равным 0,68 для регуляризации одной сигмы. Задайте частичный удельный объем, плотность буфера и вязкость, полученные из SEDNTURP. Нажмите Выполнить, чтобы позволить программному обеспечению решить уравнение лама.
Нажмите Fit для уточнения. Выберите Show Peak Mw в CS в функции отображения главной панели инструментов для оценки молекулярных масс. Смешайте двухмикромолярный тетрамер H3/H4 и четырехмикромолярный димер H2A/H2B с возрастающими концентрациями гистонового шаперона, варьирующиеся от одного до шести микромолярного, в сборочном буфере до конечного объема 50 микролитров.
Инкубировать смесь при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. Одновременно предварительно обрабатывают 500 нанограммов отрицательно перекрученной плазмиды PUC-19 одним микрограммом фермента топоизомеразы I в сборочном буфере в конечном объеме в 50 микролитров. Затем соедините предварительно смешанный раствор, содержащий тетрамер, димер и гистоновый шаперон, с расслабленной плазменной ДНК.
Добавьте 100 микролитров 2X стоп-буфера и инкубируйте, чтобы завершить реакцию сборки путем депротеинизации плазмидной ДНК. Добавьте равный объем насыщенного трисом фенола в пробирку, содержащую реакционную смесь, и хорошо перемешайте содержимое реакционной смеси. Затем центрифугируйте образец.
Аккуратно соберите верхнюю водную фазу, содержащую плазмидную ДНК, с помощью микропипетки и смешайте равный объем хлороформа. Вихрь смеси. Далее собирают верхнюю водную фазу, добавляют 1/10 объема трехмолярного ацетата натрия рН 5,5 и 2,5 объема ледяного этанола.
Хорошо перемешайте раствор, перевернув трубку три-четыре раза. Центрифугируйте образец при 16, 200 г в течение 10 минут и осторожно выбросьте супернатант. Держите трубки открытыми при комнатной температуре, пока даже следовые количества этанола не испарятся, оставляя осажденную плазмидную ДНК в трубке.
Результаты анализа SEC показали, что рекомбинантный N-концевой нуклеоплазминовый домен белка Arabidopsis thaliana FKBP53 представляет собой пентамер из 65 килодалтон в растворе. Образец нуклеоплазмина, подвергнутый термической обработке, показал, что домен является высокотермостабильным. Нуклеоплазминовый домен проявлял соляную стабильность до двух моляров хлорида натрия и стабильность мочевины до четырех моляров.
Анализ показал, что взаимодействие нуклеоплазминового домена с димером H2A/H2B было стабильным до 0,4-молярного хлорида натрия, тогда как связь с H3/H4 была стабильной до 0,7 моляров. Шаперон связывает димер H2A/H2B и тетрамер H3/H4 одновременно, независимо от порядка, в котором они добавляются к шаперону, указывая на отдельные места взаимодействия для олигомеров. Расчетные молекулярные массы через AUC-SV показывают стехиометрию нуклеоплазминового домена 1:1 с гистоновыми олигомерами.
В плазмидном суперспирали, рекомбинантные растительные гистоновые шапероны AtNRP1 и AtNRP2 увеличили количество суперспирализованной плазмиды, предполагая, что она может откладывать гистоны на ДНК с образованием нуклеосом, вызывая суперспирализацию ДНК. Плазмидный суперспиральный анализ нуждается в особом уходе и возможной оптимизации для характеристики ДНК гистонов и шаперонов. Телеметрия изомерных характеристик может использоваться в качестве продолжения аналитических экспериментов по исключению размеров для подтверждения стабильности связывания.
