Этот пошаговой протокол показывает, как обнаружить и функционально охарактеризовать энзиматической активности RING типа E3 убиквитин лигазы, как в пробирке и в planta, через сайт-направленный подход мутагенез. Вводя мутацию в домене RING через мутагенез, направленный на сайт, полученный мутант E3-дефицит может быть протестирован параллельно с белком дикого типа, чтобы связать энзиматические действия с функциональностью. Выяснение биохимической и механической основы ubiquitin лигазов типа RING может внести значительный вклад в наше понимание их биологической значимости в развитии, сигнализации стресса и поддержании гомеостаза.
При незначительной модификации системы экспрессии in vivo этот протокол может быть применен к анализу любой лигизы типа RING E3 независимо от ее происхождения. Начните с выявления сохраненных Cys и его аминокислот в домене RING и проектирование грунтовки, которые несут замену кодон интереса в окружении 15 базовых пар по обе стороны от места мутации. Очень важно правильно идентифицировать домен RING, особенно его сохраненные остатки цистеина и гистидина.
Для этого можно использовать онлайн-инструменты, такие как PROSITE. Используйте мутагенные грунтовки в усилении ПЦР, чтобы ввести желаемую мутацию в плазмидную укрывательство гена интереса, убедившись, что использовать полимеразу ДНК высокой точности, такие как Pfu. После ПЦР, переварить E.coli полученных родительских метилированной и полу-метилированной ДНК, добавив три микролитров фермента ограничения Dpnl непосредственно к реакции ПЦР и инкубации его при 37 градусов по Цельсию в течение двух часов.
Очистим мутагенизированные плазмиды коммерческим набором для извлечения ДНК и утепать ДНК в 50 микролитров воды. Затем преобразуй химически компетентные клетки DH5-альфа E.coli с помощью 0,5 микролитров восстановленной мутагенизированной плазмидной ДНК в соответствии с протоколом производителя. Клонировать дикий тип RING и мутировавшие гены RING, представляющие интерес для вектора pMAL-c2, чтобы сплавить эти гены с тегом эпитопа MBP.
Затем установите реакцию убиквитина in vitro в общем объеме 30 микролитров, как описано в рукописи, и инкубировать смесь при 30 градусах по Цельсию в течение двух часов. Прекратите реакцию, смешивая образец с 7,5 микролитров 5x SDS-PAGE загрузки буфера и кипения его в течение пяти минут, а затем отделить белки с 7,5%SDS-полиакриламид гель электрофорез. Передача на мембрану PVDF, и обнаружить убиквитина с западной blotting и анти-FLAG.
Пятно мембраны с Coomassie синий, чтобы проверить равную нагрузку испытания MBP-RING типа белка. Streak Agrobacterium tumefaciens штаммов проведения эпитопа помечены ген интереса на LB среды, содержащей соответствующий выбор антибиотиков. После двух дней роста при 28 градусах по Цельсию, выбрать одиночные колонии, и выращивать их в жидкой среде LB с антибиотиками при 28 градусов по Цельсию и 250 об / мин в течение еще 24 часов.
Перенесите 100 микролитров агробактериальной культуры на три миллилитров свежего ЛБ с антибиотиками и инкубировать культуру еще на четыре-шесть часов. Спин вниз клетки на 1, 800 раз г в течение шести минут, отказаться от супернатанта, и повторного перерасхода клеток с тремя миллилитров мыть буфера. Повторите мыть два раза, затем повторно использовать клетки в буфер индукции, и инкубировать их в течение дополнительных 10 до 12 часов при 28 градусов по Цельсию.
После инкубации центрифуга клетки в 1800 раз г в течение шести минут, и отказаться от супернатанта. Повторное использование клеток с двумя миллилитров буфера инфильтрации, и определить концентрацию бактерий, использующих значение OD600. Агроинфильтрат четырехнедельной Никотиана бентамиана листья, мягко колоть их иглой, и ручной инъекции Agrobacterium со шприцем, а затем круг проникли области с маркером.
Через 36 часов соберите проникшие листовые ткани и измельчите ее до мелкого порошка с жидким азотом. Повторно порошок ткани с 300 микролитров буфера извлечения белка, и центрифуга его на 15000 раз г в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию. Перенесите супернатант в свежую трубку, добавьте 5x буфер загрузки SDS-PAGE в окончательную концентрацию 1x и варите образец в течение пяти минут.
Затем выполните западный анализ помарки для обнаружения в субоквитинации растений. Streak соответствующие штаммы Agrobacterium tumefaciens проведения помечены гены интереса или пустой вектор, и вводить Agrobacterium на листьях Никотиана бентамиана, как описано ранее. Для E3-зависимой деградации субстрата белка, следуйте ранее описанного протокола, и выполнять западные blotting с соответствующими антителами для обнаружения накопления белка в клетках растений.
Для E3-зависимых гиперчувствительных ответ опосредованной ингибирования смерти клеток, контролировать агроинфильтрированных листьев для симптомов смерти клеток два-четыре дня после инфильтрации. Типичный результат анализа убиквитина in vitro содержит многополосный мазок, начинающийся с молекулярного веса тестируемого белка и прогрессирующий вверх. Как и ожидалось, отрицательный контроль, в результате чего отсутствовали отдельные компоненты или использовался MBP, не продемонстрировал смазанный сигнал.
Кроме того, голубое окрашивание оболочки PVDF coomassie показало равную загрузку MBP-RHA1B или MBP во всех элементов управления. 11 различных E2s были протестированы, чтобы исследовать, как в пробирке убиквитинации варьируется в зависимости от конкретной комбинации E2 к E3. Обнаруженная активность убиквитина варьировалась от сигнала до многополосного мазка, начиная с различных молекулярных весов, что указывает на различные модели убиквитина.
Версии RING-и K-mutant RHA1B были протестированы на убиквитину in vitro и в planta. Отсутствие энзиматической активности версии RING-мутантов подтверждается его неспособностью либо генерировать многополосный мазок in vitro, либо продвигать полиубикитинирование сигнала в плантах. Несмотря на то, что в пробирке для мутанта K был обнаружен маргинальный сигнал самоокибитации, в плантах была обнаружена только фоновая убиквитина, что свидетельствует о том, что остатки K146 также необходимы для активности E3.
В отличие от дикого типа RHA1B, мутант RING, не лишенный активности лигозы E3, не мешал гиперчувствительной реакционо-клеточной смерти. Западный blotting подтвердил, что Gpa2 не накапливается в присутствии дикого типа RHA1B, но мутант RING не влияет на стабильность белка. Учитывая, что правильная комбинация E2-E3 необходима для реакции убиквитинации, анализы убиквитина in vitro следует проводить параллельно с несколькими ферментами E2, представляющими различные классы E2, чтобы избежать ложных отрицательных результатов.
Мутант E3 с дефицитом лигазы облегчает тестирование ферменто-субстратных взаимодействий in vivo. Кроме того, этот мутант часто дает доминирующий отрицательный фенотип, который может быть использован в функциональных исследованиях нокаута в качестве альтернативного подхода к РНК. Используя этот протокол, было недавно установлено, что RHA1B нематод эффектор вмешиваться в растительной иммунной сигнализации в E3-зависимой образом, ориентируясь на завод Gpa2 иммунорецептор для убиквитина и деградации.
