Минископ in vivo кальциевая визуализация позволяет исследователям исследовать пространственно и временно скоординированную активность сотен нейронов в глубоких структурах мозга свободно ведущих себя животных. Минископ in vivo кальциевая визуализация предлагает множество преимуществ, в том числе возможность выполнять записи, которые являются специфическими для типа клеток, крупномасштабными и продольными. Наш хирургический протокол для вирусных инъекций и имплантации линз GRIN совместим с любыми коммерческими или специально построенными однофотонными и двумя фотонными системами визуализации для глубокой визуализации мозга in vivo кальция.
Продемонстрировать процедуру будет Рашми Тхапа, аспирант из моей лаборатории. После дезинфекции выбритой хирургической области анестезированной мыши используйте скальпель, чтобы сделать двухсантиметровый разрез через кожу вдоль средней линии, чтобы обнажить лямбду и брегму черепа. После размещения 0,5-миллиметрового зубного бормашины в положение переднего заднего 1,94 миллиметра и медиального бокового 0,5 миллиметра от брегмы, приступайте к сверлению черепа.
Далее загружают вирус в микролитровый шприц с помощью панели управления микронасоса и извлекают 500 нанолитров воздушного пузыря с последующим 800 нанолитрами вируса со скоростью потока 50 нанолитров в секунду. Медленно переместите иглу в мозговую ткань к целевой координате Z дорсального вентра 1,75 миллиметра, а затем слегка переместите ее вверх до координаты Z дорсального вентра 1,65 миллиметра. На панели управления настройте микронасос на впрыскивание 500 нанолитров вируса со скоростью потока 50 нанолитров в минуту, прежде чем нажать кнопку «Выполнить» для инъекции вируса.
Когда инъекция закончится, выровняйте края кожи и аккуратно закройте разрез швом 4-0. Нанесите антибиотическую мазь на область шва, чтобы предотвратить инфекцию. Чтобы имплантировать градиентный индекс или линзу GRIN, иссечение треугольной области кожи высотой 1,5 сантиметра и основанием 1,5 сантиметра от передней стороны между глазами до задней стороны позади лямбды с помощью мелких ножниц.
После того, как череп будет тщательно очищен и высушен, нанесите цианоакрилат на края кожи и прикрепите кожу к черепу. Через пять минут, когда цианоакрилат высохнет, расположите зубной бормашину диаметром 1,2 миллиметра в положение передней задней части 1,94 миллиметра, медиальной боковой 0,8 миллиметра от брегмы. Просверлите череп с последующим удалением твердой мозговой оболочки с помощью кончика иглы 30 калибра.
Очистите все куски костного мусора острыми щипцами под углом 45 градусов. Затем прикрепите вручную отполированную тупую концевую иглу 27 калибра к держателю иглы, соединенному с роботизированной рукой, наклоненной под углом 10 градусов, и подключите другой конец держателя иглы к домашней вакуумной системе. Найдите кончик иглы, чтобы просто коснуться брегмы, прежде чем нажать кнопку Bregma, чтобы установить Z-координату брегмы на ноль.
Установите входное значение X равным 0,8, входное значение Y 1,94, введите значение Z равным 1,0 и нажмите кнопку «Найти», чтобы переместить иглу на верхнюю часть просверленного отверстия на черепе. Центрируйте кончик иглы к просверленному отверстию и опустите его до нулевого положения Z. Включите вакуум и начните промывать открытую область мозга искусственной спинномозговой жидкостью или ACSF через систему трубок с гравитационным управлением, подключенную к игле 30-го калибра с изогнутым наконечником.
ACSF непрерывно пузырится с газовой смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа при фильтрации через 0,2-микронный фильтр. Используя программное обеспечение AutoStereota, аспирация мозговой ткани завершится в четыре раунда. Для первого раунда аспирации убедитесь, что значение Z отображается как ноль.
Затем в сеансе zStep щелкните и проверьте первую и вторую строки. Задайте значения для первой строки равными 0,2 и 1. Задайте значения для второй строки равными 0,15 и 4.
В сеансе Mode установите размер иглы 27 калибра и 1.2. Набор Димс 0.9. Все остальные значения будут по умолчанию.
Чтобы начать аспирацию, последовательно нажмите на кнопки NotSet, KeepZero и Пуск. Первый раунд аспирации генерирует карман колонны глубиной 0,8 миллиметра и диаметром 1 миллиметр. В третьем раунде аспирации щелкните и проверьте первую строку для сеанса zStep и установите значения для первой строки равными 1,8 и 1.
В сеансе Mode установите размер иглы 27 калибра и 2.2. Начните стремление, сохранив другие ценности такими же, как и в предыдущем раунде. После третьего раунда аспирации глубина кармана колонны составляет 1,8 миллиметра.
Последний раунд стремления — очистить кровь, скопившуюся на дне кармана. Установите значения для первой строки равными 1,6 и 1 в сеансе zStep и установите размер иглы 27 калибра и 2,2 и Dims 0,6 в сеансе mode перед началом аспирации. Как только карман освободится от крови, прекратите вакуум, прекратите орошение ACSF и подведите иглу на 2 миллиметра в координате Z и на 0,5 миллиметра вперед к центру.
Поместите стерильный 1-миллиметровый хрусталик GRIN в карман мозговой ткани. Далее применяем расплавленную агарозу в промежутке между хрусталиком GRIN и мозговой тканью с помощью шпателя. После того, как агароза образует гель, удалите избыток агарозы с помощью микролопасти.
Смешайте стоматологический цементный порошок и каталитическую жидкость в предварительно охлажденном смесительном колодце и нанесите слой самоотверждающегося клейкого смоляного цемента на череп, начиная с окружения линзы GRIN, а затем покрывая весь открытый череп. В чистом пластиковом колодце смешайте зубной цементный порошок и черный древесный уголь с жидкостью, чтобы нанести тонкий слой смеси поверх первого слоя зубного цемента. Дайте ему затвердеть в течение пяти минут.
Подключите Miniscope к кабелю и включите специально разработанное программное обеспечение NuView. В NuView щелкните Оборудование, проверьте LED1 и нажмите кнопку Поток, чтобы просмотреть живые изображения. Чтобы остановить прямую трансляцию, нажмите кнопку Стоп.
Затем поместите минископ в специально изготовленный минископ. С помощью моторизованных контроллеров расположите минископ чуть выше экспонированного объектива GRIN, сделав его параллельным поверхности объектива. Медленно опустите минископ к объективу GRIN и отрегулируйте его положение Z, пока не будет найдена лучшая плоскость фокусировки.
Нанесите первый слой зубного цемента вокруг основания минископа без изменения положения минископа. После того, как цемент затвердеет, аккуратно снимите удерживающую руку, чтобы минископ мог самостоятельно стоять на головке мыши. Нанесите второй слой зубного цемента вокруг основания, чтобы заполнить все зазоры, гарантируя, что из зазоров не будет утечки светодиодного света.
Дайте зубному цементу затвердеть. После кратковременного обезболивания мыши изофлураном ослабьте запирающий винт в основании небольшой отверткой перед снятием защитного колпачка и очистите поверхность линзы GRIN пропитанным ацетоном ватным тампоном. Подключите минископ к кабелю и запустите программное обеспечение NuView, чтобы начать определение наилучшей фокальной плоскости с регулировки положения минископа относительно основания путем слегка затяжки или ослабления с помощью тупых щипцов.
Как только будет определена лучшая фокальная плоскость, затяните стопорный винт, прежде чем отсоединить кабель и поместить мышь обратно в домашнюю клетку. Включите программное обеспечение поведенческой камеры для просмотра арены поведения мыши с помощью функции прямой трансляции. Вручную отрегулируйте фокус верхней камеры.
Выберите Триггер Строб и установите флажок Включить/выключить триггер, а затем нажмите кнопку Запись. Затем нажмите кнопку Обзор, чтобы выбрать место, где будут сохраняться записи поведения. Выберите нужный формат изображения.
Поднесите мышь близко к арене и подключите miniscope к кабелю, подключенному к системе сбора данных. Затем поместите мышь в центр арены. В программном обеспечении поведенческой камеры нажмите кнопку Начать запись.
В NuView проверьте LED1, нажмите «Захват», а затем запустите кнопки, чтобы начать запись. Это позволяет одновременно записывать визуализацию кальция и поведение мыши. Нажмите «Стоп» через 3 000 кадров и сохраните файлы.
Когда запись будет завершена, кратковременно обезболите мышь изофлураном, отсоедините минископ от основания и наденьте защитный колпачок на основание, прежде чем поместить мышь обратно в ее домашнюю клетку. Клеточная карта из субоптимальной визуализации кальция in vivo содержала некоторые активные нейроны, в то время как карта успешной визуализации включала несколько сотен активных нейронов в сфокусированной области. В типичном примере неудачной визуализации кальция in vivo область была темной и содержала менее пяти активных нейронов, или область была яркой, но не имела активных нейронов.
В репрезентативном анализе показана карта клеток максимальной проекции флуоресценции и переходных процессов кальция из последовательной записи визуализации кальция in vivo. Посмертная оценка экспрессии GCaMP6f и имплантация линзы GRIN в медиальный PFC экспериментальной мыши показали, что GCaMP6f был экспрессирован и линза GRIN была имплантирована точно в нужную область мозга. Чтобы получить хорошую визуализацию кальция, необходимо убедиться, что кровотечение полностью остановилось и поле свободно от сгустков крови, прежде чем имплантировать линзу GRIN.
Этот метод может быть использован для изучения изменений нейронной цепи в мышиной модели различных расстройств головного мозга человека и проверки, может ли кандидат на лекарство нормализовать измененную схему.
