Наш протокол помогает визуализировать оксигенацию многоклеточных сфероидов с помощью обычного флуоресцентного микроскопа. Используя этот метод, можно произвести тысячи окрашенных кислородным зондом сфероидных микротузий и впоследствии использовать их в приложениях 3D-печати. Например, васкуляризованные трансплантаты костной ткани.
кислородный зонд ближнего инфракрасного диапазона совместим с использованием других красителей, таких как зеленое флуоресцентное окрашивание в конечном счете, это позволяет проводить живой и многопараметрический долгосрочный анализ. Переложите микроструктурированные штампы PDMS из флакона для хранения в стерильную чашку Петри и высушите на воздухе гладкую поверхность вверх в условиях стерильного ламинарного воздушного потока в течение 10 минут. Поместите каждый штамп в середину лунки 12-луночной стерильной ткани.
Воздух сухой в течение одной-двух минут с открытой крышкой. Подготовьте 50 миллилитров 3% однородного раствора агарозы и сразу же добавьте примерно два миллилитра горячего раствора агарозы в каждую лунку из 12-луночных пластин для покрытия вставленной штампа PDMS. Затвердевают агарозу в течение 20 минут, инкубируя ее под стерильным воздушным потоком.
Используя стерильный шпатель, переверните агарозу со встроенным штампом PDMS вверх дном в каждой лунке. Добавьте приблизительно 200 микролитров стерильной воды на гладкую верхнюю сторону штампа. Отсоедините его от агарозы шпателем и извлеките из колодца.
Добавьте один миллилитр соответствующей стерильной клеточной культуральной среды к маркам агарозы для непосредственного использования. Накройте тарелку крышкой и высиживаете в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Перед использованием прогрейте пластины с микроструктурированным агарозой в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе углекислого газа.
Промыть от 70% до 90% культуры сливающихся клеток предварительно подогретым PBS. Добавьте диссоциирующий раствор фермента и инкубируйте в течение трех-пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Позже нейтрализуют трипсин с помощью полной клеточной культуральной среды, содержащей 10% FBS.
Чтобы получить одноклеточную суспензию, диссоциируйте клеточные агрегаты, используя наконечник пипетки 1000 микролитров в верхней части серологической пипетки. Используя счетную камеру, подсчитайте количество ячеек на миллилитр клеточной суспензии. Разбавьте клеточную суспензию до 500 000 клеток на миллилитр и добавьте в нее концентрированный раствор кислородного зонда.
Удалите старую среду из микроструктурированных лунок 12-луночной пластины для культивирования клеток с агарозным покрытием и добавьте в лунки один миллилитр подготовленной клеточной суспензии. Культивируйте сфероиды в инкубаторе углекислого газа в течение двух-пяти дней в непрерывном присутствии кислородного зонда, чтобы обеспечить его нагрузку во время образования и уплотнения сфероидов. Закройте конец стерильного картриджа объемом три кубических сантиметра крышкой наконечника и заполните биочернилами путем пипетки.
Вставьте поршень в картридж и держите его вверх ногами. Снимите крышку наконечника и нажмите поршень к биочернилам до тех пор, пока весь воздух из картриджа не будет удален. Охладите биочернила в нагревательной мантии биопринтера при 23 градусах Цельсия.
Распылите биопринтер 70% этанолом и высушите впитывающейся бумагой. Вкрутите адаптер давления в верхней части картриджа. Установите коническую полиэтиленовую иглу 22 калибра на картридж.
Установите картридж в нагревательную мантию на печатающей головке на основе экструзии. Подключите нажимное отверстие и откройте зажим на входе. Загрузите файл G-кода вашего дизайна в программное обеспечение для печати.
Начните измерение длины иглы. Отрегулируйте давление печати, дозируя немного биочернил в стерильной чашке Петри. Установите шестискважинную плиту, откройте плиту скважины, закройте вытяжку и распечатайте.
После печати пусть каркасы будут физически сшиты в течение 10 минут при пяти градусах Цельсия. Облучайте напечатанные леса в течение 60 секунд ультрафиолетовой светодиодной лампой. Немедленно добавьте соответствующие питательные среды, содержащие двойной раствор антибиотика, во все скважины с биопечатными сетками.
Культивируйте строительные леса при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе углекислого газа. Для микроскопического наблюдения перенесите печатную вафельную сетку в крышку тарелки для микроскопии с носителями изображений. Используя одну миллилитровую пипетку, аккуратно вымойте предварительно окрашенные сфероиды кислородного зонда из микролунок агарозы и перенесите их в 15-миллилитровую коническую донную трубку.
Чтобы обеспечить сбор всех сфероидов из микроструктурированного колодца, промыть лунку один-три раза дополнительным миллилитром культуральной среды и объединить все сфероидные суспензии в одном флаконе. Оставьте флакон вертикально на срок до 10 минут, чтобы сфероиды осели на дне. Осторожно извлеките среду из трубки, оставив сфероиды нетронутыми.
Добавьте свежую питательную среду, которой будет достаточно, по крайней мере, для 20 сфероидов на чашку для образца и осторожно повторно суспендируйте сфероиды путем пипетки. Сразу же добавляйте равный объем сфероидной суспензии в каждую предварительно покрытую микроскопию. Оставьте сфероиды на один час при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы хорошо прикрепиться к поверхности микроскопии.
Хорошо извлеките среду из микроскопии и промойте один раз с помощью носителей для визуализации. Добавьте в образец точное количество носителей изображений. Хорошо настройте микроскопию с окрашенными сфероидами на стадии микроскопии.
Используя объектив с 10-кратным увеличением, просмотрите образец в проезжающем свете. Сделайте предварительную фокусировку на сфероидах, расположите их в центре изображения и приведите объектив с требуемым большим увеличением в рабочее положение. Сосредоточьтесь на режиме пропускания света в экваториальном сечении сфероида.
Отрегулируйте параметры для сбора флуоресцентных или фосфоресцентных сигналов опорных и чувствительных спектральных каналов кислородного зонда и запустите процесс визуализации. Откройте файл vsi с данными об интенсивности кислородного зонда из эталонных и чувствительных спектральных каналов в объединенном режиме. Откройте окно функции анализа соотношений из меню измерения.
Выберите интенсивность опорного канала в качестве числителя и интенсивность чувствительного канала в качестве знаменателя для расчета R. В окне анализа соотношений примените соответствующие пороговые значения интенсивности к каждому спектральному каналу, чтобы вычесть фон из объединенного изображения интенсивности. Маски ROI, применяемые к сфероидным изображениям, определяют сфероидные границы.
Увеличьте пороговые значения до тех пор, пока фон изображения не станет равномерно черным. В окне анализа соотношения настройте коэффициент масштабирования на изображение соотношения до тех пор, пока изображение предварительного просмотра не обеспечит требуемое разрешение градиента R. Изображение распределения коэффициента интенсивности добавляется в виде слоя к исходному многоканальному изображению.
В окне многоканального изображения активируйте слой с ложной цветовой шкалой. Вручную определите пределы связывания и разъединения гистограммы распределения соотношений с помощью фиксированного параметра масштабирования в окне отображения настроек. Откройте соответствующее пропускающее световое изображение сфероидов.
Выберите функцию линейной линейки и измерьте диаметр сфероидов. Экспорт данных в виде файла таблицы электронной таблицы. Выберите ROI необходимого размера и формы и нанесите его на периферию и гипоксическое ядро сфероида.
Преобразуйте ROI в объект измерения, чтобы проанализировать средний R внутри выбранного ROI. Экспорт данных в табличный формат, совместимый с электронной таблицей. Применяйте измерения к каждому микроскопическому участку сфероидов для получения набора данных диаметров сфероидов RC и RP для выполнения дальнейших расчетов и статистического сравнения.
Объедините все данные в одном файле электронной таблицы. Зонд MMIR1 имеет низкое фотоотбеливание и подходит для исследования в режиме реального времени быстрого респираторного ответа у сфероидов hDPSC на различные стимулы митохондрий. FCCP проявлял только мягкий эффект разъединения в некоторых областях, а затем немного уменьшал клеточное дыхание.
С другой стороны, ротенон сильно ингибировал дыхание, что приводило к реоксигенации сфероидов и рассеиванию градиентов кислорода периферии к ядру в течение примерно 80 секунд после стимуляции. Используя автоматизированный протокол расчета соотношения интенсивности пикселей, предоставляемый программным обеспечением для визуализации, в режиме реального времени обнаруженные периферические градиенты кислорода во всех типах сфероидов визуализируются с оксигенированной периферией и гипоксическими нишами в центре. На графиках, представленных здесь, показаны профили соотношений экваториальных сфероидных поперечных сечений для различных типов сфероидов.
По сравнению с гомоклеточными сфероидами hDPSC, гетероцеллюлярные сфероиды hDPSC к HUVEC имели значительно более крутые градиенты. Градиент кислорода периферии-ядра в гетероклеточных сфероидах, вероятно, генерируется hDPSC в их составе в соответствии с оксигенацией сфероидов hDPSC, обладающих сильной дыхательной активностью. Графики показывают, что биопечатные сфероиды hDPSC имели значительно насыщенную кислородом периферию, чем сфероиды, измеренные до биопечати, в то время как их оксигенация ядра имела аналогичные значения.
Если случайное осаждение зонда нарушает равномерное образование сфероидов, фильтруйте или центрифугируйте раствор зонда с высокой скоростью перед использованием. Коррекция измерения длины иглы и регулирование давления являются важными шагами для соответствия скорости биопечати и диаметру стойки, а также микроагрегатам биопечати в пористом каркасе. Выберите параметры микроскопии для визуализации чувствительных к кислороду зондов, учитывая их влияние на фотостабильность зонда.
Кислородная визуализация совместима со многими типами измерений живой микроскопии. После визуализации можно также выполнить иммунофлуоресценцию, извлечь белки для вестерн-блоттинга или выполнить анализ экспрессии генов.
