Наш протокол важен тем, что он обеспечивает эффективное крупномасштабное производство гомогенных тканевых сфероидов, которые имеют решающее значение для нашей передовой тканевой инженерии, разработки лекарств и моделирования заболеваний. Основным преимуществом этого метода является его способность быстро и экономически эффективно производить большое количество однородных тканевых сфероидов, обеспечивает высокую жизнеспособность клеток и качество состоящего сфероида, что имеет решающее значение для наших различных биомедицинских применений. в том числе и онкологические. Этот метод может дать представление об исследованиях рака, нейродегенеративных заболеваний и тканевой инженерии, а также может быть применен для разработки лекарств и персонализированной медицины, улучшая наше понимание различных биологических систем.
Наша демонстрация зрения имеет решающее значение, поскольку она наглядно иллюстрирует сложные этапы, такие как введение устройства и посев клеток, помогая предотвратить распространенные ошибки, а также обеспечивая надлежащую технику в качестве подушки для стабильных результатов. Начните с добавления порошка агарозы в один х PBS, чтобы приготовить 2% агарозный гель в стеклянной емкости. Гомогенизируйте суспензию круговыми движениями.
Поместите стеклянную емкость в микроволновую печь и установите время на 30 секунд. Останавливайте микроволновую печь каждые пять секунд, достаньте стеклянную бутылку и вручную гомогенизируйте раствор круговыми движениями. Выполняйте процесс нагрева, пока раствор не достигнет жидкого прозрачного состояния.
Далее добавьте по шесть миллилитров раствора агарозы в каждую лунку шестилуночной пластины и подождите 15 минут или пока агароза застынет. Затем аккуратно вставьте напечатанное на 3D-принтере биоустройство над жидкой агарозой и подождите 30 минут или пока агароза застынет. Затем аккуратно выньте прибор из агарозы и добавьте два миллилитра среды DMEM.
Подождите 10 минут, прежде чем выбросить носитель и заменить его свежим DMEM. Повторите стирку три раза. Как только это будет сделано, добавьте два миллилитра DMEM и поместите шестилуночную пластину для посева клеток при температуре 37 градусов Цельсия в инкубатор с 5% углекислого газа и влажностью 80%.
Выращивайте клетки фибробластов мыши в колбах для клеточных культур и поддерживайте их при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислого газа до достижения 80% конфлюенции. Затем промойте клетки одним х PBS и добавьте фермент диссоциации. Инкубируйте клетки в течение двух-пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислом газе и 80% влажности.
После того, как клетки отделяются от колбы с клеточной культурой, добавьте питательную среду для нейтрализации фермента диссоциации клеток. Центрифугируйте клеточную суспензию при 400 G в течение пяти минут при комнатной температуре и подсчитайте клетки. Чтобы умножить на 50 умножить на 10 в степень пяти ячеек, взятых в пробирку, прибавьте пять миллилитров одной х ПБС.
Далее центрифугируйте клеточную суспензию при 400 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Удаляют надосадочную жидкость с помощью пипетки перед добавлением одного миллилитра среды для клеточных культур и гомогенизацией раствора. Из подготовленной ранее шестилуночной пластины удалите два миллилитра среды и добавьте один миллилитр клеточной суспензии в центр агарозной формы, образованной с помощью напечатанного на 3D-принтере биоустройства.
Подождите от 20 до 30 минут, пока клетки осядут в микрорезекциях, прежде чем добавлять в лунку один миллилитр среды для клеточных культур. Поместите шестилуночный планшет в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия примерно на 24–48 часов для формирования тканевого сфероида. Напечатанное на 3D-принтере устройство, похожее на штамп, состоящее из цилиндрических микроконтактов, было успешно изготовлено методом стереолитографии с использованием фотоотверждаемой смолы.
Устройство было простым, легко стерилизовалось, многоразовым, а также настраивалось под различные размеры луночных тарелок и чашек Петри. Он генерировал 750 гомогенных микрорезекций лунок или 4 716 на шестилуночные планшеты. Раннее извлечение устройства из пластины нарушило неприлипающую форму и деформировало геометрию микрорезекции.
Клетки, посеянные на неадгезивные агарозные формы, оседали и образовывали тканевые сфероиды примерно через 24 часа. Эта методология успешно продемонстрировала крупномасштабное производство сфероидов за счет сохранения их формы, размера и жизнеспособности, а также поддерживала стероидную культуру в течение нескольких месяцев. Самое главное, что нужно помнить, когда я думаю об этой процедуре, это осторожно вставлять устройство, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха, и аккуратно добавлять питательную среду, чтобы не потревожить клетки.
После этой процедуры можно провести тестирование на наркотики и анализ экспрессии генов. Ответы на вопросы об эффективности лекарств, вкусе и генетической реакции на лечение. Этот метод позволит проводить новые исследования в области тканевой инженерии и регенеративной медицины, позволяя производить широкомасштабные высококачественные сфероиды, критически важные для 3D-биопечати, а также повысить качество и количество клеток для фармацевтических и косметических испытаний на токсичность.
